Лечение должно быть начато врачом. Далее с разрешения врача поддерживающую дозу больной может вводить себе самостоятельно (если препарат назначен п/к).
Хронический гепатит В: взрослым - по 5 млн МЕ ежедневно или по 10 млн МЕ 3 раза в неделю через день, в течение 4-6 мес (16-24 нед).
Детям - п/к в начальной дозе 3 млн МЕ/кв.м 3 раза в неделю (через день) в течение 1 нед лечения с последующим увеличением дозы до 6 млн МЕ/кв.м (максимально до 10 млн МЕ/кв.м) 3 раза в неделю (через день).
Продолжительность лечения - 4-6 мес (16-24 нед).
При отсутствии улучшения по содержанию сывороточного ДНК вируса гепатита В после лечения в течение 3-4 мес в максимальной переносимой дозе препарат следует отменить.
Рекомендации по коррекции дозы в случае уменьшения числа лейкоцитов, гранулоцитов или тромбоцитов: при снижении числа лейкоцитов менее 1.5 тыс./мкл, тромбоцитов менее 100 тыс./мкл, гранулоцитов менее 1 тыс./мкл - дозу снижают на 50%, в случае снижения числа лейкоцитов менее 1200/мкл, тромбоцитов менее 70 тыс./мкл, гранулоцитов менее 750/мкл - лечение прекращают и назначают вновь в прежней дозе после нормализации этих показателей.
Хронический гепатит С - по 3 млн МЕ через день (в качестве монотерапии или в комбинации с рибавирином). У больных с рецидивирующим течением заболевания применяется в комбинации с рибавирином. Рекомендуемая продолжительность лечения в настоящее время ограничивается 6 мес.
У больных, ранее не получавших лечение интерфероном альфа2b эффективность лечения увеличивается при использовании комбинированной терапии с рибавирином. Продолжительность комбинированной терапии не менее 6 мес. Терапию следует проводить 12 мес больным с I генотипом вируса и высокой вирусной нагрузкой, у которых к концу первых 6 мес лечения РНК вируса гепатита C в сыворотке крови не определяется. При принятии решения о продлении комбинированной терапии до 12 мес следует, также, принимать во внимание др. негативные прогностические факторы (возраст старше 40 лет, мужской пол, наличие фиброза).
В качестве монотерапии Интрон А применяется в основном при непереносимости рибавирина или при наличии противопоказаний к его применению. Оптимальная продолжительность монотерапии Интроном А еще не установлена; в настоящее время рекомендуется проводить лечение от 12 до 18 мес. В течение первых 3-4 мес лечения обычно определяют наличие РНК вируса гепатита C, после чего лечение продолжают только тем больным, у которых РНК вируса гепатита C не выявлен.
Хронический гепатит D: п/к в начальной дозе 5 млн МЕ/кв.м 3 раза в неделю в течение по крайней мере 3-4 мес, хотя может быть показана более длительная терапия. Дозу подбирают с учетом переносимости препарата.
Папилломатоз гортани: по 3 млн МЕ/кв.м п/к 3 раза в неделю (через день). Лечение начинают после хирургического (лазерного) удаления опухолевой ткани. Дозу подбирают с учетом переносимости препарата. Достижение положительного ответа может потребовать проведения лечения в течение более 6 мес.
Волосатоклеточный лейкоз: 2 млн МЕ/кв.м п/к 3 раза в неделю (через день). Дозу подбирают с учетом переносимости препарата.
Пациенты после спленэктомии и без спленэктомии, одинаково отвечали на лечение и отмечали сходное снижение потребности в трансфузиях. Нормализация одного или нескольких показателей крови обычно начинается в течение 1-2 мес после начала лечения. Для улучшения всех 3 показателей крови (числа гранулоцитов, тромбоцитов и уровня Hb) может потребоваться 6 мес или более. До начала лечения необходимо определить уровень Hb и число тромбоцитов, гранулоцитов и волосатых клеток в периферической крови и число волосатых клеток в костном мозге. Эти параметры следует периодически контролировать во время лечения с целью оценки ответа на него. Если больной отвечает на терапию, то ее следует продолжать до тех пор, пока не прекратится дальнейшее улучшение, а лабораторные показатели не будут стабильными в течение примерно 3 мес. Если в течение 6 мес больной не отвечает на терапию, лечение следует прекратить. Терапию не следует продолжать в случае быстрого прогрессирования болезни и тяжелых нежелательных явлений.
В случае перерыва в лечении Интроном А повторное его применение было эффективным более чем у 90% больных.
Хронический миелолейкоз. Рекомендуемая доза в качестве монотерапии - 4-5 млн МЕ/кв.м в день ежедневно, п/к. Для поддержания числа лейкоцитов может потребоваться применение в дозе - 0.5-10 млн МЕ/кв.м. Если лечение позволяет добиться контроля числа лейкоцитов, то для поддержания гематологической ремиссии препарат следует применять в максимальной переносимой дозе (4-10 млн МЕ/кв.м ежедневно). Препарат необходимо отменить через 8-12 нед, если терапия не привела по крайней мере к частичной гематологической ремиссии или клинически значимому снижению числа лейкоцитов.
Комбинированная терапия с цитарабином: Интрон А - 5 млн МЕ/кв.м ежедневно п/к, а через 2 нед добавляют цитарабин в дозе 20 мг/кв.м ежедневно п/к, в течение 10 дней подряд ежемесячно (максимальная доза - до 40 мг/сут). Интрон А следует отменить через 8-12 нед, если терапия не привела по крайней мере к частичной гематологической ремиссии или клинически значимому снижению числа лейкоцитов.
Исследования продемонстрировали большую вероятность достижения ответа на терапию Интроном А у больных с хронической фазой болезни. Лечение следует начинать как можно раньше после установления диагноза и продолжать до полной гематологической ремиссии или в течение по крайней мере 18 мес. У больных, отвечающих на лечение, улучшение гематологических показателей обычно наблюдается в течение 2-3 мес. У таких пациентов лечение следует продолжать до полной гематологической ремиссии, критерием которой является число лейкоцитов в крови 3-4 тыс./мкл. У всех больных с полным гематологическим эффектом лечение следует продолжать с целью достижения цитогенетического эффекта, который в некоторых случаях развивается лишь через 2 года после начала терапии.
У больных с числом лейкоцитов более 50 тыс./мкл на момент установления диагноза врач может начать лечение с гидроксимочевины в стандартной дозе, а затем, когда число лейкоцитов снизится менее 50 тыс./мкл, заменить ее на Интрон А. У больных с вновь выявленной хронической фазой Ph-позитивного хронического миелолейкоза проводилась также комбинированная терапия Интроном А и гидроксимочевиной. Лечение Интроном А начинали с доз 6-10 млн МЕ/сут п/к, затем добавляли гидроксимочевину в дозе 1-1.5 г 2 раза в сутки, если исходное число лейкоцитов превышало 10 тыс./мкл, и продолжали ее применение до тех пор, пока число лейкоцитов не снижалось менее 10 тыс./мкл. Затем гидроксимочевину отменяли, а дозу Интрона А подбирали т.о., чтобы число нейтрофилов (палочкоядерных и сегментоядерных лейкоцитов) составляло 1-5 тыс./мкл, а число тромбоцитов более 75 тыс./мкл.
Тромбоцитоз, ассоциированный с хроническим миелолейкозом: 4-5 млн МЕ/кв.м в день, ежедневно, п/к. Для поддержания числа тромбоцитов может потребоваться применение препарата в дозах 0.5-10 млн МЕ/кв.м.
Неходжкинская лимфома: п/к - 5 млн МЕ 3 раза в неделю (через день) в сочетании с химиотерапией.
Саркома Капоши на фоне СПИДа: оптимальная доза не установлена. Имеются данные об эффективности Интрона А в дозе 30 млн МЕ/кв.м 3-5 раз в нед. Препарат также применяли в меньших дозах (10-12 млн МЕ/кв.м/сут) без явного снижения эффективности.
В случае стабилизации заболевания или ответа на лечение, терапию продолжают до тех пор, пока не произойдет регресс опухоли или не потребуется отмена препарата (развитие тяжелой оппортунистической инфекции или нежелательного побочного явления). В клинических исследованиях больные со СПИДом и саркомой Капоши получали Интрон А в сочетании с зидовудином по следующей схеме: Интрон А - в дозе 5-10 млн МЕ/кв.м, зидовудин - 100 мг каждые 4 ч. Основным токсическим эффектом, ограничивавшим дозу, была нейтропения. Лечение Интроном А можно начать
субстанция-раствор: пачки Рег. №: ЛСР-007009/08
Клинико-фармакологическая группа:
Форма выпуска, состав и упаковка
субстанция -раствор.
бутыли (1) - пачки картонные.
Описание активных компонентов препарата «Интерферон альфа-2b »
Фармакологическое действие
Интерферон. Представляет собой высокоочищенный рекомбинантный протеин с молекулярной массой 19 300 дальтон. Получен из клона Escherichia coli путем гибридизации плазмид бактерий с геном человеческих лейкоцитов, кодирующим синтез интерферона. В отличие от интерферона альфа-2а имеет аргинин в положении 23.
Оказывает противовирусное действие, которое обусловлено взаимодействием со специфическими мембранными рецепторами и индукцией синтеза РНК и, в конечном счете, белков. Последние, в свою очередь, препятствуют нормальной репродукции вируса или его высвобождению.
Обладает иммуномодулирующей активностью, которая связана с активацией фагоцитоза, стимуляцией образования антител и лимфокинов.
Оказывает антипролиферативное действие на опухолевые клетки.
Показания
Острый гепатит B, хронический гепатит B, хронический гепатит C.
Волосатоклеточный лейкоз, хронический миелолейкоз, почечно-клеточная карцинома, саркома Капоши на фоне СПИД, кожная T-клеточная лимфома (грибовидный микоз и синдром Сезари), злокачественная меланома.
Режим дозирования
Вводят в/в или п/к. Дозу и схему лечения устанавливают индивидуально, в зависимости от показаний.
Побочное действие
Гриппоподобные симптомы: часто - лихорадка, озноб, боли в костях, суставах, глазах, миалгия, головная боль, повышенное потоотделение, головокружение.
Со стороны пищеварительной системы: возможно уменьшение аппетита, тошнота, рвота, диарея, запор, нарушение вкусовых ощущений, сухость во рту, уменьшение массы тела, слабо выраженные боли в животе, небольшие изменения показателей функции печени (обычно нормализуются после окончания лечения).
Со стороны ЦНС и периферической нервной системы: редко - головокружение, ухудшение умственной деятельности, нарушение сна, нарушения памяти, беспокойство, нервозность, агрессивность, эйфория, депрессия (после длительного лечения), парестезии, невропатия, тремор; в отдельных случаях - склонность к самоубийству, сонливость.
Со стороны сердечно-сосудистой системы: возможны - тахикардия (при лихорадке), артериальная гипотензия или гипертензия, аритмия; в отдельных случаях - нарушения деятельности сердечно-сосудистой системы, ИБС, инфаркт миокарда.
Со стороны дыхательной системы: редко - боли в груди, кашель, небольшая одышка; в отдельных случаях - пневмония, отек легкого.
Со стороны системы кроветворения: возможна незначительная лейкопения, тромбоцитопения, гранулоцитопения.
Дерматологические реакции: возможны зуд, обратимая алопеция.
Прочие: редко - мышечная скованность; в единичных случаях - антитела к природным или рекомбинантным интерферонам.
Противопоказания
Тяжелые сердечно-сосудистые заболевания, декомпенсированный цирроз печени, тяжелая депрессия, психоз, алкогольная или наркотическая зависимость, повышенная чувствительность к интерферону альфа-2b.
Беременность и лактация
Применение при беременности возможно только в том случае, когда предполагаемая польза терапии для матери превосходит потенциальный риск для плода.
Неизвестно, выделяется ли интерферон альфа-2b с грудным молоком. При необходимости применения в период лактации следует решить вопрос о прекращении грудного вскармливания.
Женщинам детородного возраста в период лечения следует использовать надежные средства контрацепции.
Применение при нарушениях функции печени
Противопоказан при декомпенсированном циррозе печени. С осторожностью применять у пациентов с нарушениями функций печени.
Применение при нарушениях функции почек
С осторожностью применять у пациентов с нарушениями функции почек.
Особые указания
С осторожностью применять у пациентов с нарушениями функций почек, печени, костномозгового кроветворения, при склонности к суицидальным попыткам.
У пациентов с заболеваниями сердечно-сосудистой системы возможна аритмия. Если аритмия не уменьшается или усиливается, дозу следует уменьшить в 2 раза, либо прекратить лечение.
В период лечения необходим контроль неврологического и психического статуса.
При выраженном угнетении костномозгового кроветворения необходимо регулярное исследование состава периферической крови.
Интерферон альфа-2b оказывает стимулирующее действие на иммунную систему, поэтому следует с осторожностью применять у пациентов, склонных к аутоиммунным заболеваниям, из-за повышения риска аутоиммунных реакций.
Лекарственное взаимодействие
Лекарственное взаимодействие
Интерферон альфа-2b ингибирует метаболизм теофиллина и снижает его клиренс.
Препарат синтезируется бактериальными клетками штамма Escherichia coli SG-20050/pIF16, в генетический аппарат которых встроен ген человеческого интерферона альфа-2b. Препарат представляет собой белок, который содержит 165 аминокислот, он идентичен по свойствам и характеристикам лейкоцитарному интерферону альфа-2b человека. Противовирусное действие проявляется во время репродукции вируса, происходит активное включение препарата в метаболические процессы клеток. Реагируя со специфическими рецепторами на поверхности клеток, препарат инициирует ряд внутриклеточных изменений, в том числе продукцию специфических ферментов (протеинкиназы и 2-5-аденилатсинтетазы) и цитокинов, действие которых замедляет синтез рибонуклеиновой кислоты вируса в клетке и вирусного белка. Повышает фагоцитарную активность макрофагов, усиливает специфическое цитотоксическое действие лимфоцитов на клетки-мишени. Изменяет функциональную активность иммунокомпетентных клеток, качественный и количественный состав декретируемых цитокинов, образование и секрецию внутриклеточных белков. Подавляет пролиферацию опухолевых клеток и образование некоторых онкогенов, что угнетает опухолевый рост.
Максимальная концентрация препарата при парентеральном введении достигается через 2 - 4 часа. Через 20 - 24 часа после введения препарат в плазме крови не определяется. Концентрация препарата в сыворотке крови на прямую зависит от кратности и дозы введения. Метаболизируется в печени, выводится, главным образом, через почки, частично в неизмененном виде.
Показания
Терапия и профилактика гриппа и острых респираторно-вирусных инфекций; экстренная профилактика клещевого энцефалита вместе с противоклещевым иммуноглобулином; атопические заболевания, аллергический риноконъюнктивит, бронхиальная астма при проведении специфической иммунотерапии.
Комплексное лечение у взрослых: острый вирусный гепатит В (среднетяжелые и тяжелые формы в начале желтушного периода до пятого дня желтухи (в поздние сроки препарат менее эффективен; при холестатическом течении заболевания и развивающейся печеночной коме препарат не эффективен); острый затяжной гепатит В и С, хронический активный гепатит В и С, хронический гепатит В с дельта агентом; волосатоклеточный лейкоз, рак почки IV стадии, злокачественные лимфомы кожи (первичный ретикулез, грибовидный микоз, ретикулосаркоматоз), базальноклеточный и плоскоклеточный рак кишки, саркома Капоши, сублейкемический миелоз, кератоакантома, гистиоцитоз из клеток Лангерганса, хронический миелолейкоз, эссенциальная тромбоцитемия; вирусные конъюнктивиты, кератиты, кератоконъюнктивиты, кератоувеиты, кератоиридоциклиты; урогенитальная хламидийная инфекция; лихорадочная и менингеальная форма клещевого энцефалита.
Комплексное лечение у детей от 1 года: респираторный папилломатоз гортани, начиная со следующего дня после удаления папиллом; острый лимфобластный лейкоз в периоде ремиссии после окончания индукционной химиотерапии (на 4-5 месяце ремиссии).
Способ применения интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного и дозы
Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный вводится внутримышечно, подкожно, в очаг поражения, субконъюнктивально, принимается внутрь, используется местно. Способ применения, дозы, режим и длительность лечения устанавливаются индивидуально в зависимости от показаний, возраста, состояния пациента, переносимости препарата.
Во время лечения общие клинические анализы крови необходимо проводить каждые 2 недели, биохимические - каждые 4 недели. При снижении абсолютного числа нейтрофилов менее 0,50 Х 10^9/л, а числа тромбоцитов менее 25 Х 10^9/л, терапию следует отменить. При снижении абсолютного числа нейтрофилов менее 0,75 Х 10^9/л, а числа тромбоцитов менее 50 Х 10^9 /л рекомендуется временно снизить дозу препарата в 2 раза и повторить анализ через 1 - 2 недели; при сохранении изменений терапию рекомендовано отменить.
За пациентом следует установить тщательное наблюдение при появлении признаков нарушения функционального состояния печени. Использование препарата следует прекратить при прогрессировании симптомов.
При развитии реакций повышенной чувствительности (ангионевротический отек, крапивница, анафилаксия, бронхоспазм) препарат отменяют и немедленно назначают соответствующее медикаментозное лечение.
Необходимо тщательно контролировать функциональное состояние почек при наличии легкого и умеренного нарушения функции почек.
При длительном использовании препарата возможно развитие пневмоний и пневмонитов. Купированию легочных синдромов способствуют своевременная отмена препарата и назначение глюкокортикостероидов.
При появлении изменений со стороны центральной нервной системы или/и психики, включая депрессию, необходимо наблюдение психиатра во время лечения и в течение полугода после его окончания. После прекращения лечения данные расстройства обычно быстро обратимы, но иногда для их полного обратного развития необходимо до 3 недель. Рекомендуется обеспечить консультацию психиатра и прекратить терапию препаратом, если появляются агрессивное поведение, направленное на других людей, или суицидальные мысли, симптомы расстройства психики ухудшаются или не регрессируют. Суицидальные мысли и попытки чаще отмечаются у пациентов детского и подросткового возраста, чем у взрослых. Если лечение с применением препарата признано необходимым у взрослых больных с серьезными нарушениями психики (включая в анамнезе), то его следует начинать, только если проводится лечение психического нарушения и соответствующий индивидуальный скрининг. Применение препарата у пациентов до 18 лет с серьезными нарушениями психики (включая в анамнезе) противопоказано.
У больных с патологией щитовидной железы до начала терапии необходимо определить уровень тиреотропного гормона, в дальнейшем контролировать его содержание следует не реже 1 раза в 6 месяцев, а также при появлении признаков нарушения функции щитовидной железы. Применение препарата у таких пациентов следует проводить под контролем эндокринолога. При появлении нарушений функции щитовидной железы или ухудшения течения имеющихся заболеваний, которые не поддаются лечению, необходимо отменить препарат.
При продолжительном использовании препарата возможны нарушения со стороны органа зрения. Рекомендуется провести офтальмологическое обследование до начала лечения. При любых жалобах со стороны органа зрения необходима немедленная консультация офтальмолога. Больным с заболеваниями, при которых могут происходить изменения в сетчатке (артериальная гипертензия, сахарный диабет и другие), необходимо проходить офтальмологический осмотр не реже 1 раза в полгода. При усугублении или появлении зрительных расстройств необходимо рассмотреть вопрос об отмене терапии.
Больным с прогрессирующими онкологическими заболеваниями или/и патологией сердечно-сосудистой системы необходимо тщательное наблюдение и контроль электрокардиограммы. При появлении артериальной гипотензии следует обеспечить соответствующее лечение и адекватную гидратацию.
У пациентов пожилого возраста, которые получают препарат в высоких дозах, возможны кома, нарушения сознания, энцефалопатии, судороги. При развитии этих нарушений и неэффективности снижения дозы, терапию отменяют.
При продолжительном использовании препарата у некоторых пациентов могут появляться антитела к интерферону. Обычно титры антител невысоки, их появление не снижает эффективность лечения.
У пациентов после трансплантации медикаментозная иммуносупрессия может быть менее эффективной, так как интерферон стимулирует иммунную систему.
С осторожностью назначают больным с предрасположенностью к аутоиммунным заболеваниям. При развитии симптомов аутоиммунного заболевания необходимо провести тщательное обследование и оценить возможность продолжения лечения интерфероном. Иногда лечение препаратом связано с обострением или возникновением псориаза, саркоидоза.
Во время лечения следует соблюдать осторожность при занятии потенциально опасными видами деятельности, где необходимы повышенное внимание и быстрота психомоторных реакций, (включая управление автотранспортом) а при развитии усталости, сонливости, дезориентации или прочих побочных реакций необходимо отказаться от такой деятельности.
Противопоказания к применению
Гиперчувствительность, тяжелые заболевания сердечно-сосудистой системы (недавно перенесенный инфаркт миокарда, сердечная недостаточность в стадии декомпенсации, выраженные нарушения сердечного ритма), тяжелые аллергические заболевания, тяжелая печеночная или/ почечная недостаточность, аутоиммунный гепатит, хронический гепатит с декомпенсированным циррозом печени, психические заболевания и расстройства у детей и подростков, эпилепсия и прочие нарушения функции центральной нервной системы, аутоиммунные заболевания в анамнезе, использование иммунодепрессантов после трансплантации, патология щитовидной железы, которая не поддается контролю общепринятыми терапевтическими методами; беременность, период грудного вскармливания, использование у мужчин, партнерши которых беременны.
Ограничения к применению
Выраженная миелосупрессия, печеночная и/или почечная недостаточность, заболевания щитовидной железы, псориаз, саркоидоз, хронические обструктивные болезни легких, сахарный диабет, склонность к кетоацидозу, нарушения свертываемости крови, психические нарушения, в особенности выражающиеся депрессией, суицидальными мыслями и попытками в анамнезе.
Применение при беременности и кормлении грудью
Использование препарата противопоказано при беременности и кормлении грудью.
Побочные действия интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного
Сердечно-сосудистая система и кровь:
преходящая обратимая кардиомиопатия, аритмии, артериальная гипотензия, инфаркт миокарда, лейкопения, лимфопения, тромбоцитопения, анемия.
Пищеварительная система:
сухость во рту, боли в животе, тошнота, диспепсия, снижение массы тела, нарушения аппетита, диарея, рвота, панкреатит, гепатотоксичность, повышение активности аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы.
Нервная система и органы чувств:
раздражительность, депрессия, нервозность, астения, беспокойство, бессонница, нарушение способности к концентрации внимания, агрессивность, суицидальные мысли, нейропатии, психоз, нарушение слуха, отек конъюнктивы нижнего свода, гиперемия и единичные фолликулы слизистой оболочки глаза, очаговые изменения глазного дна, снижение остроты зрения, неврит зрительного нерва, кровоизлияния в сетчатку, тромбоз артерий и вен сетчатки, отек диска зрительного нерва.
Кожные покровы:
повышенное потоотделение, сыпь, зуд, выпадение волос, местная воспалительная реакция.
Эндокринная система:
изменения со стороны щитовидной железы, сахарный диабет.
Костно-мышечная система:
рабдомиолиз, боль в спине, судороги в ногах, миозит, миалгии.
Дыхательная система:
фарингит, диспноэ, кашель, пневмония.
Мочевыделительная система:
почечная недостаточность, повышение концентрации креатинина, мочевины.
Иммунная система:
аутоиммунная патология (ревматоидный артрит, васкулит, волчаночноподобный синдром), саркоидоз, анафилаксия, ангионевротический аллергический отек, отек лица.
Прочие:
гриппоподобный синдром (повышение температуры, озноб, астения, утомляемость, усталость, артралгии, миалгии, головные боли).
Взаимодействие интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного с другими веществами
Препарат снижает клиренс и в 2 раза увеличивает концентрацию аминофиллина в плазме.
При совместном использовании с амфотерицином B возрастает риск развития поражения почек, гипотензии, бронхоспазма; с бусульфаном - веноокклюзионной болезни печени; с дакарбазином - гепатотоксичности; с зидовудином - нейтропении.
Препарат усиливает токсичность доксорубицина.
При совместном использовании с левотироксином натрия изменяет эффект, может потребоваться коррекция дозы.
При совместном использовании с пэгаспаргазой взаимно возрастает риск развития побочных эффектов.
Препарат может снижать активность изоферментов цитохрома Р-450 и, тем самым, влиять на метаболизм фенитоина, циметидина, курантила, диазепама, варфарина, теофиллина, пропранолола, некоторых цитостатиков.
Может усилить миелотоксическое, нейротоксическое, кардиотоксическое действие препаратов, которые назначались ранее или совместно.
Избегать одновременного использования с препаратами, которые угнетают центральную нервную систему, иммуносупрессивными средствами (включая глюкокортикостероиды).
Не рекомендуется употребление алкоголя во время терапии.
При совместном использовании гидроксимочевиной может повышаться частота развития кожного васкулита.
При совместном использовании с теофиллином необходимо контролировать концентрацию теофиллина в плазме крови и при необходимости корректировать режим дозирования.
Передозировка
При передозировке препаратом усиливаются побочные эффекты. Необходима отмена препарата, проведение симптоматического и поддерживающего лечения.
Торговые названия препаратов с действующим веществом интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный
Комбинированные препараты:
Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный + Дифенгидрамин: Офтальмоферон®.
Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии, медицине, фармакологии. Новая рекомбинантная мультикопийная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека, экспрессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. В результате трансформации клеток реципиентного штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 получен штамм Е. coli SX50 - продуцент рекомбинантного лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека с продуктивностью до 0.9-1.0 г альфа-2b интерферона с 1 л культуральной среды. Способ получения рекомбинантного альфа-2b интерферона основан на использовании созданного рекомбинантного штамма Е. coli SX50 и предусматривающий его глубинное культивирование на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком давлении, растворение агрегированного белка в концентрированном растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов и его очисткой с использованием трехстадийной хроматографической очистки интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow иммобилизованной ионами Cu +2 , ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа СМ Sephsrose Fast Flow и гель фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75. Способ позволяет получать субстанцию интерферона более 99% чистоты по данным электрофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром и более 98% по данным RF HPLC и не содержащую пирогенов (LAL-тест) в количествах не менее 400-800 мг с 1 л культуральной среды. 3 н. и 3 з.п ф-лы, 6 ил.
Рисунки к патенту РФ 2242516
Изобретение относится к генно-инженерным лекарственным препаратам, получаемым биотехнологическим путем, а именно к способам промышленного получения рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека медицинского назначения (далее интерферон), а также к рекомбинантньм штаммам продуцентам Escherichia coli (E.coli) и плазмидным ДНК, кодирующим синтез интерферона.
Интерфероны представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой от 15000 до 21000 дальтон, продуцируемые и секретируемые клетками в ответ на вирусную инфекцию или другие возбудители. Выделяют три основные группы интерферонов: альфа, бета и гамма. Сами по себе эти группы не являются однородными и могут содержать несколько различных молекулярных разновидностей интерферона. Так, выделено более 14 генетических разновидностей интерферона альфа, которые представляют интерес и находят широкое применение в медицине в качестве противовирусных, антипролиферативных и иммуномодулирующих средств.
Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами (SU1713591, RU 2066188 , RU 2080873).
Основным недостатком этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.
В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.
В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.
Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995), является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза. Недостатком использования штаммов Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli (Semin. Oncol.,1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9):S9-41-S9-51).
Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 ( RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.
Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.
Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.
Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 ( RU 2054041). Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.
В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: P lac , P t7 и P trp , и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.
Экспрессия интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: P lac , P t7 и P trp . Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии (RU 2165455).
Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона. Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда "течет". Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате - снижение выхода интерферона.
Задачей данного изобретения является конструирование рекомбинантого промышленного штамма продуцента Е. coli с помощью новой рекомбинантной плазмидной ДНК, обладающего высоким уровнем биосинтеза интерферона, и разработка эффективной промышленной технологии получения субстанции интерферона медицинского назначения, соответствующей по качеству "European Pharmacopoeia " для субстанции интерферона альфа-2b.
Указанная задача решалась созданием рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 и штамма Escherichia coli SX50, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных штаммов ФГУП ГосНИИ генетики, номер ВКПМ В-8550,
а также способом получения рекомбинантного альфа-2b интерферона, основанным на использовании рекомбинантного штамма Е. coli SX50 и предусматривающим его глубинное культивирование на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком давлении, растворение агрегированного белка в концентрированном растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов и трехстадийной хроматографической очисткой интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованной ионами Сu +2 , ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа CM Sepharose Fast Flow и гель фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75.
Согласно изобретению предлагается новая рекомбинантная мультикопийная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека, экспрессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. Плазмида pSX50 имеет 3218 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием следующих фрагментов:
Последовательность с 1 нуклеотида по 176 нуклеотид (н.) включает фрагмент ДНК размером 176 п.о., содержащий триптофановый промотор (P trp);
Последовательность с 177 н. по 194 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий последовательность Шайн Дельгарно, ответственный за инициацию трансляции;
Последовательность с 195 н. по 695 н. включает фрагмент ДНК размером 501 п.о., содержащий последовательность гена интерферона со следующими нуклеотидными заменами: в положении 37 замена А на С, в положении 39 замена G на Т, в положении 40 замена А на С, в положении 42 замена G на Т, в положении 67 замена А на С, в положении 69 замена G на Т, в положении 70 замена А на С, в положении 72 замена А на Т, в положении 96 замена G на А, в положении 100 замена А на С, в положении 102 замена А на Т, в положении 114 замена А на С, в положении 120 замена С на G, в положении 126 замена G на А, в положении 129 замена G на А, в положении 330 замена С на G, в положении 339 замена G на А, в положении 342 замена G на А, в положении 487 замена А на С, в положении 489 замена А на Т, в положении 495 замена G на А;
Последовательность с 696 н. по 713 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий синтетический полилинкер;
Последовательность с 714 н. по 1138 н. включает фрагмент ДНК плазмиды рКК223-3 с 4129 н. по 4553 н. размером 425 п.о., содержащий последовательность строгого терминатора транскрипции rrnBT 1 T 2 ;
Последовательность с 1139 н. по 1229 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 2487 н. по 2577 н. размером 91 п.о., содержащий промотор гена -лактомазы (ген устойчивости к ампициллину - Аmр R);
Последовательность с 1230 н. по 2045 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC4K с 720 н. по 1535 н. размером 816 п.о., содержащий структурную область гена kan;
Последовательность с 2046 н. по 3218 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 1625 по 453 н. размером 1173 п.н., содержащий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды (ori) и lac промотора (P lac).
На фиг.1-5 изображены схемы конструирования и физическая карта плазмиды рSХ50.
На фиг.6 представлена установленная для плазмиды pSX50 полная последовательность нуклеотидов.
Штамм Escherichia coli SX50 получен трансформацией клеток Escherichia coli BL21 плазмидой pSX50 с использованием традиционной генно-инженерной технологии. Штамм E.Coli SX50 характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки
Клетки мелкие, прямые, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" образуются круглые, гладкие, выпуклые, мутные, блестящие, серые колонии, с ровными краями. При росте в жидких средах (в минимальной среде с глюкозой или в LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки
Аэроб. Температурный диапазон роста 4-42°С при оптимуме рН 6,5-7,5.
В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д.
В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы. Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к канамицину (до 100 мкг/мл).
Штамм Escherichia coli 8Х50 - продуцент интерферона.
Способ, условия и состав среды для хранения штамма
В L-arape с добавлением канамицина до концентрации 20 мкг/мл под маслом, в L-бульоне, содержащем 15% глицерина и соответствующими антибиотиками в ампулах при температуре минус 70°С, в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре плюс 4°С.
Штамм Escherichia coli SX50 идентифицирован по Определителю Берги (1974) как штамм вида Escherichia coli.
Способ промышленного получения альфа-2b интерферона
Особенностью заявляемого способа является разработка технологии, позволяющая выделять интерферон из нерастворимой формы, накапливающейся в течение ферментации, что позволяет существенно упростить технологическую схему процесса выделения и повысить выход целевого продукта.
Способ заключается в культивировании штамма Escherichia coli SХ50 в питательной среде, с постоянным добавлением питательных субстратов, предпочтительно глюкозы и дрожжевого экстракта, в процессе биосинтеза, предпочтительно с пониженным содержанием триптофана, механическом разрушении клеток микроорганизма при высоком давлении 700-900 bar, растворении интерферона в буферном растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов, с последующей трехстадийной хроматографической очистке интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованных ионами Сu +2 , ионообменную хроматографию на ионообменных смолах типа CM Sepharose Fast Flow и гель фильтрационную хроматографию на смолах типа Superdex 75.
Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения интерферона являются следующие:
Ферментацию проводят при непрерывном добавлении субстратов в течение всего процесса, что обуславливает высокий уровень экспрессии интерферона;
Разрушение клеток осуществляют в дезинтеграторе типа Гаулин при давлении 900 bar;
Удаление растворимых клеточных компонентов (ДНК, РНК, белков, липополисахаридов и т.д.) производят промыванием нерастворимой формы интерферона буферными растворами, содержащими детергенты (Тритон XI00, мочевина и т.д.);
Образовавшийся осадок, содержащий интерферон, растворяют в буферном растворе 6 М гуанидина гидрохлорида;
Ренатурацию интерферона проводят в физиологическом буферном растворе, содержащем хаотропные агенты;
Трехстадийную хроматографическую очистку интерферона проводят на Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованной ионами Сu +2 , на катионообменной смоле СМ Sepharose Fast Flow и гель фильтрационную хроматографию на смоле типа Superdex 75;
После каждой хроматографической очистки проводят стерилизующую фильтрацию через апирогенные фильтры с размерами пор 0.22 мкм.
Выход интерферона в результате применения описанного способа составляет примерно 400-800 мг интерферона с 1 л культуральной среды. Качество получаемого продукта соответствует нормам и требованиям "European Pharmacopoeia" для субстанции альфа-2b интерферона.
Существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются:
Использование конструкции штамма, с более высокой производительностью, что позволяет получать при биосинтезе большее количество интерферона с 1 л культуральной среды;
Использование эффективного механического разрушения клеточной биомассы, что позволяет получать более чистый экстракт нерастворимой формы интерферона за более короткое время, с меньшими потерями;
Использование физиологических буферных растворов при ренатурации в присутствии хаотропных агентов позволяет повысить выход корректно ренатурированной формы интерферона;
Трехстадийная хроматографическая очистка интерферона позволяет получать субстанцию интерферона более 99% чистоты по данным электрофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром и более 98% по данным RF HPLC и практически не содержащую пирогенов (LAL-тест).
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды рSХ50
Способ конструирования плазмиды pSX50 включает следующие этапы:
Конструирование векторной плазмиды pSX10;
1. конструирование плазмиды pSX3 (2641 п.о.)
2. конструирование векторной плазмиды pSX10 (2553 п.о.)
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX41 (3218 п.о.);
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX43 (3218 п.о.);
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX45 (3218 п.о.);
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX50 (3218 п.о.).
Конструирование векторной плазмиды pSX10
Векторная плазмида pSX10 представляет собой вектор pUC19, в котором кодирующая последовательность гена бета лактомазы, обеспечивающая устойчивость к ампициллину, заменяется кодирующей последовательностью гена kаn и содержит терминатор транскрипции из плазмиды рКК223-3.
Конструирование векторной плазмиды pSS10 проводят в две стадии:
Получение плазмиды pSX3 (2641 п.о.), представляющей собой плазмиду pUC19, в которой кодирующая область аmp гена заменяется на кодирующую область гена kan;
Получение веторной плазмиды pSX10 (2553 п.о.), представляющей собой плазмиду pSX3, в которой за BamHI сайтом вставлен фрагмент ДНК, кодирующий терминатор транскрипции ггBT 1 T 2 .
Для получения плазмиды pSX3 проводят пять раундов амплификации ДНК методом ПЦР (полимеразная цепная реакция). В ходе первого раунда, используя ДНК плазмиды pUC19 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 1828 п.о. (фрагмент PU1-PU2) с помощью праймеров:
Данную и последующие ПЦР реакции проводят в следующих условиях: 20 mМ Tis-HCl, рН 8.8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4 ,10 mМ КСl, 2 тМ MgCl 2 , 0.1% Triton Х100,0.1 mg/ml BSA, 0.2 mM каждого dNTP, 1.25 ед. Pfu ДНК полимеразы, 100 нг ДНК. Процесс амплификации состоит из следующих стадий: прогревание при 95°С 5 мин, 35 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 2 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. После амплификации (и после последующих амплификаций) фрагмент ДНК очищают электрофоретически в 1% агарозном геле. В ходе второго и третьего раундов, используя ДНК плазмиды pUC4K в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 555 п.о. (фрагмент КМ1-КМ2) с помощью праймеров:
и амплификацию фрагмента ДНК размером 258 п.о. (КМЗ-КМ4) с праймеров
В пятом раунде ПЦР проводят объединение фрагментов (PU1-PU2) и (КМ1-КМ4) в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 5 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. ДНК, полученную после последней ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате получают плазмиду рSХ3 размером 2641 п.о.
Для получения векторной плазмиды pSX10 проводят три раунда амплификации ДНК методом ПЦР. В ходе первого раунда, используя ДНК плазмиды pSX3 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 2025 п.о. (фрагмент 10.1-10.2) с помощью праймеров:
В ходе второго раунда, используя ДНК плазмиды рКК223-3 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 528 п.о. (фрагмент КК1-КК2) с помощью праймеров:
В третьем раунде ПЦР проводят объединение фрагментов (10.1-10.2) и (КК1-КК2) в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 5 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. ДНК, полученную после последней ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате получают плазмиду pSX10 размером 2553 п.о.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX41
Рекомбинантная плазмида pSX41 представляет собой Hind III - BamHI фрагмент ДНК векторной плазмиды pSX3 (2529 п.о.), Hind III - EcoRI фрагмент ДНК размером 168 п.о., кодирующий промотор триптофанового оперона Е. coli (P trp), EcoRI-XbaI синтетический фрагмент ДНК размером 20 п.о., кодирующий SD последовательность (Шайн-Дельгарно) и XbaI-BamHI фрагмент ДНК размером 501 п.о., кодирующий ген альфа 2b интеферона человека.
Для получения Hind III - ВаmHI фрагмент ДНК векторной плазмиды pSX3 (2529 п.о.) ДНК плазмиды pSX3 обрабатывают ферментами рестрикции HindIII и BamHI с последующей электрофоретической очисткой в 1% агарозном геле. Hind III EcoRI фрагмент ДНК размером 168 п.о., кодирующий промотор триптофанового оперона (P trp) получают методом ПЦР, используя тотальную ДНК Е. coli в качестве матрицы и праймеры TRP1 и PRP2 с последующей обработкой амплифицированного фрагмента рестриктазами Hindlll и EcoRI:
Для получения EcoRI-Xbal синтетический фрагмент ДНК размером 20 п.о., кодирующий SD последовательность (Шайн-Дельгарно), синтезируются следующие комплементарные олигонуклеотиды:
XbaI-ВаmIII фрагмент ДНК размером 501 п.о., кодирующий ген альфа 2b интеферона человека, получают методом ПЦР, используя тотальную ДНК человека в качестве матрицы и праймеры IFN1 и IFN2 с последующей обработкой амплифицированного фрагмента рестриктазами Xbal и ВаmIII:
Далее электрофоретически очищенные фрагменты объединяют, лигируют ферментом лигаза фага Т4, ДНК трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX41 размером 3218 п.о. Далее проводят поэтапный мутагенез гена интерферона для увеличения уровня экспрессии целевого продукта. Мутагенез гена интерферона заключается в замене редко встречающихся в Е. coli триплетов, кодирующих соответствующие аминокислоты на часто встречающиеся в Е. coli триплеты, кодирующие эти же аминокислоты. Мутагенез ДНК гена интерферона проводят методом ПЦР.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX43
Для получения рекомбинантной плазмиды pSX43 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX41 в качестве матрицы и праймеры IFN3 и IFN4:
ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду рSХ43 размером 3218 п.о.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX45
Для получения рекомбинантной плазмиды pSX45 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX43 в качестве матрицы и праймеры IFN5 и IFN6:
ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX45 размером 3218 п.о.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX50.
Для получения рекомбинантной плазмиды pSX50 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX45 в качестве матрицы и праймеры IFN7 и IFN8:
ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 сек 95°С, 30 сек 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX50 размером 3218 п.о.
Пример 2. Получение штамма Е. coli SX50 - продуцента интерферона
Штамм продуцент интерферона Е. coli SX50 получают путем трансформации клеток штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидой рSХ50. Штамм продуцент интерферона выращивают в 30 л ферментере до оптической плотности 25.0-30.0 о.е. в среде М9, содержащей 1% кислотного гидролизата казеина (Difco), 1% глюкозы, 40 мкг/мл канамицина, при температуре 38-39°С. В процессе ферментации проводят непрерывное добавление питательного субстрата, используя гравитометрический контроллер.
Пример 3. Способ выделения интерферона из штамма Е. coli SX50
Получение интерферона проводили в 4 этапа:
1 этап. Культивирование штамма Е. coli SX50.
2 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы интерферона.
3 этап. Растворение и ренатурация интерферона.
4 этап. Хроматографическая очистка интерферона.
1 этап. Культивирование штамма Е. coli SX50
Выращенный посевной материал штамма Е. coli SX50 в объеме 3 л богатой среде LB в течение 12 ч при 26°С асептически вносят в ферментер, содержащий 27 л стерильной среды, содержащей М9, 1% кислотного гидролизата казеина, 1% глюкозы, 1 мМ MgCl 2 , 0.1 mM CaCl 2 , 40 мг/мл канамицина. Культивирование в ферментере проводят при температуре 38-39°С, поддерживая рН 7±0,15 путем автоматической подтитровки 40%-ным раствором гидроокиси натрия. Концентрацию растворенного кислорода в диапазоне (50±10)% от насыщения поддерживают путем изменения скорости оборотов мешалки от 100 до 800 об/мин и подачи воздуха от 1 до 15 л/мин. Концентрацию субстратов, в частности глюкозы и дрожжевого экстракта, измеряют в течение ферментации и поддерживают их концентрацию путем изменения скорости подачи концентрированных растворов, через перистальтические насосы, используя гравиметрический контроллер.
Накопление интерферона в виде нерастворимой формы контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии, методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле (SDS-PAAG) и методом обратнофазной высокоэффективной хроматографии (RF HPLC). Ферментацию останавливают по достижении максимальной оптической плотности (~ 25-30 о.е.) и остановки синтеза интерферона. По окончании ферментации культуральную жидкость сепарируют центрифугированием в проточном роторе при скорости вращения 5000-10000 об/мин. Биомассу фасуют в полиэтиленовые пакеты и замораживают при температуре минус 70°С.
2 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы интерферона
300-400 г замороженной биомассы штамма Е. coli SX50 суспедируют в 3000 мл буфера 1 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Triton X100). Суспензию пропускают через проточный гомогенизатор типа Гаулин, поддерживают давление 900 бар и центрифугируют в проточном роторе при 15 000 об/мин. Полученный осадок промывают в аналогичных условиях последовательно буферами 2 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 мМ ЭДТА, 3 М мочевины) и буфером 3 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 1 мМ ЭДТА) и окончательно осадок интерферона суспедируют в 200 мл буфера 3. При этом время выделения и очистки нерастворимой формы интерферона составляет не более 5 час.
3 этап. Растворение и ренатурация интерферона
К полученной на предыдущем этапе суспензии нерастворимой формы интерферона добавляют сухой гуанидин гидрохлорид до концентрации 6 М, добавляют дитиотреитол до концентрации 50 мМ, Tris-HCl pH 8.0 до концентрации 50 мМ, NaCl до концентрации 150 мМ и Triton X100 до концентрации 0.1%, инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Нерастворившийся материал отделяют при стерилизующей фильтрации через мембраны с диаметрами пор 0.22 микрона.
Ренатурацию интерферона проводят путем медленного разбавления полученного раствора в 100-200 раз буфером 4 (20 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мМ NaCl, 0.1 мМ ЕДТА). После чего ренатурационную смесь инкубируют при постоянном перемешивании в течение 12-15 час при температуре 4-8°С. Далее добавляют сульфат магния до концентрации 1 мМ и агрегированный материал удаляют стерилизующей фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0.22 микрона.
4 этап. Хроматографическая очистка интерферона
Хроматографическую очистку интерферона осуществляют в три стадии.
1. Полученный ренатурированный интерферон на первом этапе подвергают очистке с помощью аффинной хроматографии на смоле типа Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences), иммобилизованной ионами Cu +2 . Для этого раствор интерферона наносят на колонну с Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow и интерферон элюируют буфером 0.1 М лимонной кислоты pH 2.2.
2. На второй стадии хроматографической очистки раствор интерферона наносят на катионообменную смолу типа CM Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) и интерферон элюируют градиентом растворов (0.0-0.5 М NaCl) в буфере 50 мМ Nа(СН 3 СОО), рН 5.5.
3. Очистка мономерной формы интерферона от остатков полимерных форм интерферона проводят на третьей стадии очистки интерферона гель-фильтрацией на смоле типа Superdex 75 (Amersham Biosciences). Хроматографию проводят в буфере 50 мМ Na(CH 3 COO), рН 5.0, содержащем 0.15М NaCl.
Описанный способ выделения и очистки интерферона позволяет получить 4-8 г высокоочищенного интерферона за один цикл выделения в течение 7-10 дней из биомассы, полученной с 10 л культуральной среды. Качество получаемого интерферона в полной мере соответствует требованиям "European Pharmacopoeia" для субстанции интерферона альфа-2b, а именно:
Концентрация интерферона не менее 2×10 8 МЕ/мл;
Удельная активность интерферона не менее 2.0×10 8 МЕ/мг;
Электофоретическая чистота препарата не менее 99% в редуцирующих и не редуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром;
Изоэлектрическая точка выделенного интерферона находится в районе рН 5.8-6.3;
Пептидная карта выделенного интерферона принципиально не отличается от пептидной карты для Европейского стандарта интерферона альфа 2b CRS;
Как следует из приведенных примеров, заявляемая группа изобретений позволяет получать интерферон альфа-2b с высоким выходом при относительно простой и надежной технологии.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона, характеризующаяся тем, что она имеет размер 3218 пар оснований (п.о.) и состоит из следующих фрагментов: последовательность с 1 по 176 нуклеотида (н.) включает фрагмент ДНК размером 176 п.о., содержащий триптофановый промотор (Р trp), последовательность с 177 по 194 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий последовательность Шайн Дельгарно, ответственный за инициацию трансляции, последовательность с 195 по 695 н. включает фрагмент ДНК размером 501 п.о., содержащий ген интерферона альфа-2b с нуклеотидными заменами: 37 (А>С), 39 (G>T), 40 (А>С), 42 (G>T), 67 (А>С), 69 (G>T), 70 (А>С), 72 (А>Т), 96 (G>A), 100 (А>С), 102 (А>Т), 114 (А>С), 120 (C>G),126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A>C), 489 (А>Т), 495 (G>A), последовательность с 696 по 713 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий синтетический полилинкер, последовательность с 714 по 1138 н. включает фрагмент ДНК плазмиды рКК223-3 с 4129 по 4553 н. размером 425 п.о., содержащий последовательность строгого терминатора транскрипции rrnBT 1 T 2 , последовательность с 1139 по 1229 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 2487 по 2577 н. размером 91 п.о., содержащий промотор гена -лактомазы (ген устойчивости к ампициллину -Amp R), последовательность с 1230 по 2045 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC4K с 720 н. по 1535 н. размером 816 п.о., содержащий структурную область гена kan, последовательность с 2046 н. по 3218 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 1625 по 453 н. размером 1173 п.н., содержащий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды (ori) и lac промотора (P lac).
2. Штамм бактерий Eschcerichia coli SX50 трансформированный рекомбинантной плазмидой по п.1 - продуцент рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека.
3. Способ получения интерферона альфа-2b человека, включающий культивирование штамма Escherichia coli SX5 по п.2 в питательной среде с постоянным добавлением питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при давлении 700-900 bar, растворение интерферона в буферном растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурацию интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов, трехстадийную хроматографическую очистку интерферона на смолах типа Chelating Sepharose Fast Flow, иммобилизованных ионами Сu +2 , ионообменную хроматографию на ионообменных смолах типа CM Sepharose Fast Flow и гель-фильтрационную хроматографию на смолах типа Superdex 75.
4. Способ по п.3, в котором культивирование проводят на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов, предпочтительно глюкозы и дрожжевого экстракта.
5. Способ по п.3, в котором перед растворением интерферона его очищают удалением растворимых клеточных компонентов, включающих ДНК, РНК, белки, липополисахариды, промыванием буферными растворами, содержащими детергенты типа Тритон XI 00, мочевин.
6. Способ по п.3, в котором после каждой хроматографической очистки проводят стерилизующую фильтрацию через фильтры с размерами пор 0.22 мкм.
При парентеральном введении препарата возможны озноб, повышение температуры, утомляемость, головная боль, недомогание, гриппоподобный синдром. Эти побочные эффекты частично купируются парацетамолом или индометацином.При местном применении препарата на слизистой оболочке глаза возможны конъюнктивальная инфекция, гиперемия слизистой оболочки глаза, единичные фолликулы, отек конъюнктивы нижнего свода.
При применении препарата возможны отклонения от нормы лабораторных показателей, проявляющиеся лейкопенией, лимфопенией, тромбоцитопенией, повышением уровня аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы. Для своевременного выявления указанных отклонений в ходе терапии общие клинические анализы крови необходимо повторять каждые 2 недели, а биохимические - каждые 4 недели. Как правило, эти изменения обычно бывают незначительными, бессимптомными и обратимыми.