Биологическое действие гормонов проявляется через их взаимодействие с рецепторами клеток-мишеней. Для проявления биологической активности связывание гормона с рецептором должно приводить к образованию химического сигнала внутри клетки, который вызывает специфический биологический ответ, например изменение скорости синтеза ферментов и других белков или изменение их активности. Мишенью для гормона могут служить клетки одной или нескольких тканей. Воздействуя на клетку-мишень, гормон вызывает специфическую ответную реакцию. Например, щитовидная железа - специфическая мишень для тиреотропина, под действием которого увеличивается количество ацинарных клеток щитовидной железы, повышается скорость биосинтеза тиреоидных гормонов. Характерный признак клетки-мишени
- способность воспринимать информацию, закодированную в химической структуре гормона.
Начальный этап в действии гормона на клетку-мишень - взаимодействие гормона с рецептором клетки. Концентрация гормонов во внеклеточной жидкости очень низка и обычно колеблется в пределах 10-6-10-11 ммоль/л. Клетки-мишени отличают соответствующий гормон от множества других молекул и гормонов благодаря наличию на клетке-мишени соответствующего рецептора со специфическим центром связывания с гормоном.
Рецепторы по своей химической природе являются белками и, как правило, состоят из нескольких доменов.
Сигнальными молекулами могут быть неполярные и полярные вещества. Неполярные вещества, например стероидные гормоны, проникают в клетку, проходя через липидный бислой. Полярные сигнальные молекулы в клетку не проникают, но связываются специфическими рецепторами клеточных мембран. Такое взаимодействие вызывает цепь последовательных событий в самой мембране и внутри клетки. К полярным сигнальным молекулам относят белковые гормоны (например, глюкагон, инсулин, паратгормон), нейромедиаторы (например, ацетилхолин, глицин, γ-аминомасляная кислота), факторы роста, цитокины, эйкозаноиды.
Внутренние - сигналы образуются и действуют в одной и той же клетке, часто сигналами выступают метаболиты. Они выполняются роль аллостерических активаторов/ ингибиторов ферментов.
Внешние – управляющие сигналы поступают в клетку из внешней среды.
Задачи:
Ø Внутреннее и межклеточное согласование метаболических процессов;
Ø Исключение холостых циклов метаболизма;
Ø Регуляция процессов образования и использования энергии;
Ø Поддержание гомеостаза;
Ø Приспособление организма к изменениям окружающей среды;
Сигнальные молекулы – эндогенные химические соединения, которые в результате взаимодействия с рецепторами обеспечивают внешнее управление биохимическими реакциями в клетках-мишенях.
Клетка-мишень - это клетка, имеющая специализированные воспринимающие рецепторы для данного вида сигнальных молекул.
Особенности сигнальных молекул:
ü Малый период жизни;
ü Высокая биологическая активность;
ü Уникальность действия;
ü Эффект усиления;
ü Один вид сигнальной молекулы может иметь несколько клеток-мишеней;
ü Реакция разных клеток-мишеней на одну сигнальную молекулу может отличаться;
Химические соединения, которые взаимодействуют с определенным рецептором, называют Лигандами.
Виды регуляторных эффектов:
1. Эндокринный – сигнальная молекула поступает с током крови к клетке-мишени из желез внутренней секреции (дистантное действие).
2. Паракринный - сигнальная молекула вырабатывается и действует на клетки в пределах одного органа или ткани.
3. Аутокринный - сигнальная молекула действует на клетку её образовавшую.
Классификация сигнальных молекул:
По химической природе:
o Органические – белковые соединения, стероиды и т.д
o Неорганические – оксид азота и т.д.
o Липофобные - не могут проникать через мембрану клетки. Они растворимы в воде.
o Липофильные - растворяются в жирах. Свободно проникают через ЦПМ и действуют на рецепторы внутри клетки.
По биологической природе:
o Гормоны (по месту образования) сигнальные молекулы с выраженным эндокринным эффектом.
o Факторы роста и цитокины – факторы роста. Это сигнальные молекулы белковой природы, которые выделяются неспециализированными клетками организма. Они регулируют рост, дифференцировку, пролиферацию соседних клеток. Действие пара- и аутокринно.
o Нейромедиаторы – выделяются нервными клетками и вызывают деполяризацию мембран. сигнальные молекулы, вырабатывающиеся нервными клетками, координирующие работу нейронов и управление периферическими тканями. Их действие связано с влиянием на ионные каналы. Они изменяют их проницаемость и вызывают деполяризацию мембраны. гипоталамус является компонентом и своеобразным «выходным каналом» лимбической системы. Это отдел промежуточного мозга, контролирующий различные параметры гомеостаза. С одной стороны он связан с ЦНС (центры ВНС), с другой - с гипофизом через нервные проводники и особую портальную систему.
Гипоталамус участвует во многих функциях нервной регуляции,а также регулирует эндокринную систему.
Регуляция метаболизма : внутренняя и внешняя. Внутренняя регуляция - управляющие сигналы образуются и действуют внутри одной и той же клетки (само-регуляция). Внешняя регуляция - управляющие сигналы поступают к клетке из внешней среды. Внутренняя регуляция осуществляется путём изменения активности ферментов активаторами или ингибиторами. Внешняя регуляция обеспечивается специализированными сигнальными молекулами, которые в результате взаимодействия с ферментами обеспечивают внешнее управление биохимическими процессами в клетках-мишенях.
Общие этапы действия сигнальных молекул:
1. Распознавание сигналов рецепторами клетки-мишени
2. Передача сигнала и его усиление
3. Изменение биохимических процессов в клетке
4. Элиминация сигнала
Вторые посредники в действии липофобных сигнальных молекул, цАМФ и цГМФ -зависимые механизмы действия. Аденилатциклаза, протеинкиназа. Продемонстрировать эффекты гормонов, осуществляющие регуляторное действие при участии цАМФ.
Особенности механизма липофобных сигнальных молекул:
ü Взаимодействие с поверхностным клеточным рецептором
ü Сигнал передается с рецептора внутрь клетки и усиливается там с помощью внутриклеточных регуляторов. Высокомолекулярные вторичные посредники – Мессенжеры, Низкомолекулярные – цАМФ, цГМФ, диацилглицерол, Са.
ü Биологическое действие обусловлено сочетанием регуляции активности ранее синтезированных ферментов.
Аденилатциклазный МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ, ЗАВИСИМЫЙ ОТ ЦАМФ.
Факторы, необходимые для этого:
- нерастворимая в воде сигнальная молекула;
- поверхностные рецепторы клетки-мишени;
- внутриклеточный трансдуктор G-белок. Состоит из 3 единиц: альфа, бета, гамма.
- G-белок может быть ингибирующий и активирующий. G-белок способен присоединять ГДФ или ГТФ.
- Аденилатциклаза (АЦ) (превращает АТФ в ЦАМФ);
- Протеинкиназа ЦАМФ-зависимая. Она катализирует реакцию фосфорилирования белков;
- Регуляторные элементы ДНК (ЭЕХАНСЕР и САЙЛЕНСЕР);
- ФОСФОДИЭСТЕРАЗА - разрушает ЦАМФ;
- ФОСФАТАЗА - дефосфорилируют белки;
- Белок-синтетический аппарат клетки.
Этапы, стимулирующие ЦАМФ -зависимый механизм :
1. взаимодействие сигнальной молекулы с рецептором;
2. изменение конформации G-белка;
3. замена ГДФ на ГТФ в альфа-S единице G-белка;α-субединица отделяется и добавляется к АЦ.
4. альфа-S ГТФ активирует АЦ;
5. АЦ синтезирует ЦАМФ;
6. ЦАМФ активирует ПРОТЕИНКИНАЗУ-А (ПКА);
7. ПКА фосфорилирует белки и белковые факторы транскрипции, изменяющие активность и количество ферментов;
8. Прекращение действия.
Отделение α-субединицы от АЦ
ФОСФОДИЭСТЕРАЗА - разрушает ЦАМФ.
ФОСФАТАЗА - ДЕФОСФОРИЛИРУЕТ белки.
Этапы, ингибирующие ЦАМФ -зависимый механизм:
С первого по третий те же самые этапы, отличие в G-белке (альфа-I единица). Четвёртый этап - связывание ГТФ с альфа-I единицей будет ингибировать АЦ. Ингибируюший механизм противодействует и прекращает эффекты ЦАМФ в клетке. ЦГМФ -зависимый стимулирующий механизм действия.
цЦГМФ-зависимый механизм
Рецептор встроен в мембрану клетки и связан с ферментом ГУАНИЛАТЦИКЛАЗОЙ (ГЦ). При присоединении сигнальной молекулы ГЦ активируется и катализирует реакцию ГТФ * ЦГМФ. Последний активирует ПРОТЕИНКИНАЗУ-G (ПКО), а она запускает реакцию фосфорилирования белков (ферментов и факторов транскрипции).
Альдостерон - регуляция объема внутриклеточной жидкости, повышение реабсорбции воды и натрия. Тироксин – повышение основного обмена
Основная задача фармакодинамики - выяснить, где и каким образом действуют лекарственные средства, вызывая те или иные эффекты. Благодаря усовершенствованию методических приемов эти вопросы решаются не только на системном и органном, но и на клеточном, субклеточном, молекулярном и субмолекулярном уровнях. Так, для нейротропных средств устанавливают те структуры нервной системы, синаптические образования которых обладают наиболее высокой чувствительностью к данным соединениям. Для веществ, влияющих на метаболизм, определяется локализация ферментов в разных тканях, клетках и субклеточных образованиях, активность которых изменяется особенно существенно. Во всех случаях речь идет о тех биологических субстратах-«мишенях», с которыми взаимодействует лекарственное вещество.
«Мишени» для ЛС
В качестве «мишеней» для лекарственных средств служат рецепторы, ионные каналы, ферменты, транспортные системы и гены.
Рецепторами называют активные группировки макромолекул субстратов, с которыми взаимодействует вещество. Рецепторы, обеспечивающие проявление действия веществ, называют специфическими.
Выделяют следующие 4 типа рецепторов (рис.
I. Рецепторы, осуществляющие прямой контроль за функцией ионных каналов. К этому типу рецепторов, непосредственно сопряженных с ионными каналами, относятся н-холинорецепторы, ГАМКА-рецепторы, глутаматные рецепторы.
II. Рецепторы, сопряженные с эффектором через систему «G-белки - вторичные передатчики» или «G-белки-ионные каналы». Такие рецепторы имеются для многих гормонов и медиаторов (м-холинорецепторы, адренорецепторы).
III. Рецепторы, осуществляющие прямой контроль функции эффекторного фермента. Они непосредственно связаны с тирозинкиназой и регулируют фосфорилирование белков. По такому принципу устроены рецепторы инсулина, ряда факторов роста.
IV. Рецепторы, контролирующие транскрипцию ДНК. В отличие от мембранных рецепторов I-III типов, это внутриклеточные рецепторы (растворимые цитозольные или ядерные белки). С такими рецепторами взаимодействуют стероидные и тиреоидные гормоны.
Рассматривая действие веществ на постсинаптические рецепторы, следует отметить возможность аллостерического связывания веществ как эндогенного (например, глицин), так и экзогенного (например, анксиолитики бензодиазепинового ряда) происхождения. Аллостерическое взаимодействие с рецептором не вызывает «сигнала». Происходит, однако, модуляция основного медиаторного эффекта, который может как усиливаться, так и ослабляться. Создание веществ такого типа открывает новые возможности регуляции функций ЦНС. Особенностью нейромодуляторов аллостерического действия является то, что они не оказывают прямого действия на основную медиаторную передачу, а лишь видоизменяют ее в желаемом направлении.
Важную роль для понимания механизмов регуляции синаптической передачи сыграло открытие пресинаптических рецепторов. Были изучены пути гомотропной ауторегуляции (действие выделяющего медиатора на пресинаптические рецепторы того же нервного окончания) и гетеротропной регуляции (пресинаптическая регуляция за счет другого медиатора) высвобождения медиаторов, что позволило по-новому оценить особенности действия многих веществ. Эти сведения послужили также основой для целенаправленного поиска ряда препаратов (например, празозина).
Сродство вещества к рецептору, приводящее к образованию с ним комплекса «вещество-рецептор», обозначается термином «аффинитет». Способность вещества при взаимодействии с рецептором стимулировать его и вызывать тот или иной эффект называется внутренней активностью.
Фармакодинамика - раздел фармакологии, занимающийся изучением фармакологических эффектов, вызываемых лекарственными веществами, а также изучением механизмов возникновения этих эффектов.
Лекарственные вещества, действуя на организм, вызывают различные изменения деятельности органов и, систем (например: усиление сокращений сердца, расширение просвета бронхов, понижение артериального давления, снижение температуры тела и т. д.).
Такие изменения в деятельности организма под влиянием лекарств обозначаются термином фармакологические эффекты. Для каждого лекарственного препарата характерны определенные эффекты, но с лечебными целями используют только некоторые, их называют основными фармакологическими эффектами, остальные, неиспользуемые, а иногда и нежелательные, называют побочными.
Механизмами действия называют способы, которыми лекарственные вещества вызывают указанные эффекты. Вопрос об изучении механизмов действия лекарственных препаратов является одним из наиболее сложных в фармакологии. Механизмы действия многих лекарственных препаратов, применяемых уже не одно столетие, изучены далеко не полностью. Примером может служить такой анальгетик, как морфин. Хотя механизмы действия многих препаратов еще окончательно не изучены, сегодня можно уже говорить о некоторых типовых механизмах действия.
По механизму действия все лекарственные вещества можно разделить на три группы:
Лекарственные препараты, в основе действия которых лежат физические или физико-химические механизмы. Примером могут служить: различные адсорбенты, многие присыпки, некоторые мази, некоторые слабительные (вазелиновое масло).
Лекарственные вещества, механизм действия которых обусловлен химическим взаимодействием вне клеток. Например, действие антацидов, нейтрализующих соляную кислоту желудка.
Лекарственные препараты, первично влияющие на метаболизм клеток. Так действует большинство лекарств.
Влияние лекарств на метаболизм клеток осуществляется, главным образом, за счет их взаимодействия с рецепторами. Под рецептором, в широком смысле слова, подразумевают ту структуру клетки, с которой взаимодействует препарат и тем самым меняет ее функцию.
Знание механизмов действия лекарственных препаратов очень важно и для правильного их применения и для предупреждения их нежелательных эффектов. Это приводит к тому, что фармакологи много внимания уделяют изучению механизмов действия не только новых, но и уже давно известных лекарственных препаратов.
9.1. Основные мишени действия лекарственных веществ.
Для более точного представления о механизме действия и фармакодинамике лекарственных веществ очень важное значение имеет учет специфичности, чувствительности, нейрогуморальной регуляции, рецепторов, синапсов, биологических мембран, называемых мишенями действия лекарственных веществ.
Чувствительность в широком понятии - способность животного организма реагировать на разные эндогенные и экзогенные раздражители. Во врачебной практике чаще всего о чувствительности говорят в более узком смысле, а именно как о способности анализаторов реагировать на раздражитель. Это свойство присуще всем живым организмам, но оно усложняется и совершенствуется как в филогенезе, так и в онтогенезе.
Анализаторами, по предложению И. П. Павлова, называют сложные анатомо-физиологические системы, обеспечивающие восприятие и анализ всех раздражителей, действующих на животных.
Принято учитывать чувствительность абсолютную, или минимальный порог раздражения (способность реагировать на минимальную величину раздражителя), и дифференциальную (способность реагировать на изменения интенсивности раздражения).
Различают также чувствительность протопатическую и эпикрическую. Протопатическая чувствительность есть примитивный вид чувствительности, воспринимающий только сильные механические и термические раздражения. В отличие от этого чувствительность эпикрическая более тонкая и дифференцированная.
У животных бывают очень различные нарушения чувствительности, а чаще всего:
1) гиперестезия (повышение разных видов чувствительности с понижением порога соответствующей чувствительности);
2) гиперпатия (повышенная чувствительность - болевая, температурная, тактильная) с изменением качества ощущения, с нарушением локализации и дифференциации его;
3) полиэстезия - когда одиночные раздражения воспринимаются как множественные;
4) аллоэстезия - раздражения ощущаются в другом месте;
5) аллохейрия - раздражение ощущается в симметричном участке другой стороны. Иногда извращается ощущение раздражения, например, болезненное ощущение холода или тепла.
Чувствительность сильно изменяется при разных изменениях в организме и в первую очередь при изменении состояния центральной нервной системы и симпатической иннервации. Ее можно существенно изменить фармакологическими веществами - повысить или ослабить, можно восстановить нарушенное состояние их, можно и профилактировать нарушения.
Постоянство состава внутренней среды организма и функции физиологических систем регулируются и координируются нервной системой и биологически активными веществами, содержащимися в крови, лимфе и тканевой жидкости; обычно это называется нейрогуморальной регуляцией, а активные вещества нервными и гуморальными интеграторами. В нейрогуморальной регуляции участвуют очень различные специфические и неспецифические продукты обмена веществ, в том числе медиаторы, нейрогормоны, гистамин, простагландины, олигопептиды и др.
Биологически активные вещества с током крови разносятся и вступают во взаимодействие только с соответствующими рецепторами (адрено-, холино-, серотонин-, гистамин- и др.) реактивных структур в тех или иных клетках и часто называемых «клетками-мишенями», а так как клетки разных органов имеют сходное строение, то можно говорить о действии биологически активных веществ на «орган-мишень».
Влияние биологически активных веществ обычно осуществляется через разные промежуточные соединения вторичных передатчиков, из которых очень важную роль играют аденозин-3-5-монофосфат (3-5-цАМФ - универсальный передатчик действия катехоламинов) и циклический гуанидин-З-5-монофосфат (цГМФ - посредник действия ацетилхолина, инсулина, а также многих других трофотропных веществ).
Участие вторичных передатчиков в проявлении эффекта довольно сложное, происходящее через ряд этапов. Прежде всего, они образуются и в обычных условиях жизни клетки, а под влиянием фармакологических агентов активизируются или подавляются. Необходимые условия для этого чаще всего касаются изменения тканевого обмена и активизации некоторых ферментов (аденилатциклады, фосфодиэтилэстеразы и др.). Образовавшееся биологически активное вещество передает соответствующую информацию в центральную нервную систему, т. е. в определенных условиях выполняет функцию звена рефлекторной дуги (рис. 2). Это вызывает ответную реакцию наиболее чувствительных отделов ЦНС, в результате чего изменяется поток нервных импульсов, передаваемых в рабочие органы.
Рефлекторная дуга (в ранее принятом понятии) усложняется включением гуморальных связей и поэтому представляется состоящей из звеньев, имеющих высокую специфическую чувствительность к различным фармакологическим веществам. Значение нейрогуморальных рефлекторных дуг усиливается наличием в центральной нервной системе специальных медиаторных нейронных систем (норадреналиновые, дофаминовые, серотониновые, ацетилхолиновые, гистаминовые и др.). Благодаря этим системам ЦНС не только осуществляет рефлекторную связь, но и продуцирует высокоактивные химико-фармакологические вещества типа медиаторов (пептиды, катехоламиды, ацетилхолин, серотонин, гамма-аминомасляная кислота и др.), регулирующие деятельность и мозга и всех физиологических систем. В фармакологии нейрогуморальной регуляции больше внимания теперь уделяется контролю за чувствительностью регулирования синаптической передачи, состоянием рецепторов и активностью медиаторов.
Медиаторы (нейротрансмиттеры, синаптические передатчики) - химические передатчики нервного импульса на клетки физиологических систем или на другие нервные клетки. Место передачи получило название синапсов, а химические структуры, с которыми взаимодействует медиатор, реактивными (холинергические, адренергические). Значительная часть медиаторов является биогенными аминами (декарбоксилированные производные ароматических аминокислот). Из катехоламиновых производных хорошо изучен дофамин, известный медиатор интернейронов синаптических ганглиев.
Дофаминергические нейроны имеются в лимбической системе среднего мозга, а также в гипоталамической области и в сетчатке. Норадреналин вырабатывается в мозговом веществе надпочечников, в скоплениях вненадпочечниковой хромафинной ткани, в головном мозге и в постганглионарных окончаниях симпатических нервов. Он является медиатором симпатических нейронов.
Серотонин (производное индола) - медиатор нервных сплетений кишечника; он активно влияет на дыхание и кровообращение, положительно ино- и хронотропно на сердце, возбуждает гладкие мышцы.
Ацетилхолин - уксуснокислый эфир холина - медиатор постганглионарных окончаний холинергических нервов и очень широкого влияния.
Некоторые медиаторы являются аминокислотами: глицин, глутаминовая, гамма-аминомасляная, аспарагиновая и др.
Образование медиаторов является обязательной частью нормального хода обмена веществ в пресинаптической зоне. Например, а-тирозин под влиянием фермента тирозин-3-гидроксилазы преобразуется в L-дофа, а она под воздействием дофа-декарбоксилазы переходит в дофамин. Под воздействием дофамин-гидроксилазы дофамин превращается в норадреналин, а он под воздействием фенилэтаноламин-N-метилтрансферазы - в адреналин.
Рецепторы - специфические концевые образования чувствительных нервов, воспринимающие раздражения и трансформирующие энергию внешнего раздражения в процесс нервного возбуждения. Они информируют головной мозг животного о состоянии и изменениях внутренней и внешней среды.
Рецепторы, обеспечивающие основное действие лекарств, называют специфическими.
Сродство вещества к рецептору, приводящее к образованию с ним комплекса, обозначается термином аффинитет. Способность вещества при взаимодействии с рецептором вызывать тот или иной эффект, называется внутренней активностью вещества.
Лекарства, вызывающие при взаимодействии с рецептором биологический эффект, называют агонистами. Возможно связывание двух различных агонистов с разными участками макромолекулы рецептора. Это явление носит название аллостерического взаимодействия. В этом случае одно вещество может повышать или снижать аффинитет другого. Например, сибазон аллостерически повышает аффинитет ГАМК к соответствующим рецепторам.
Вещества, не вызывающие эффекта при взаимодействии с рецепторами, но уменьшающие или устраняющие эффекты агонистов, носят название антагонистов.
Кроме специфических рецепторов существуют еще неспецифические, с ними могут связываться многие лекарственные вещества, не вызывая при этом никаких эффектов. Примером могут служить рецепторы белков плазмы крови.
Фармакологические рецепторы, включенные в мембраны клеток, называют мембранными рецепторами, а рецепторы, находящиеся в цитоплазме, называют цитоплазматическими.
Клеточные рецепторы воспринимают всю информацию из окружающей среды и одновременно являются тригерными (пусковыми) механизмами, запускающими деятельность клетки.
К воспринимающим приборам относятся рецепторы всех органов чувств (осязание, обоняние, вкус, слух, зрение) и специальные рецепторные образования в органах и тканях.
Характерным для любых рецепторов является восприятие только определенных видов (и даже в очень незначительной силе) раздражения. Разнообразие раздражителей рецепторов привело к сложности строения и большой дифференциации этих биологических структур, к образованию множества типов сенсорных органов.
Различают рецепторы - воспринимающие раздражения из внешней среды (экстерорецепторы), из внутренних органов (интерорецепторы), а также из скелетных мышц и сухожилий (проприорецепторы).
В зависимости от особенностей раздражителя различают механорецепторы, хеморецепторы, терморецепторы, а также рецепторы, воспринимающие боль, свет, звук, вкус, запах и др.
Высокая чувствительность анализаторов, как полагают, обеспечивается наличием в рецепторах специальных сенсибилизаторов или структур, обеспечивающих трансформацию энергии раздражения в возбудительный процесс.
Реакция анализаторов на лекарственное вещество тем значительнее, чем выше концентрация его и чем больше площадь контакта с тканями. Изменение возбудителей рецептора и порог его неодинаковы при воспалении, а также при разном состоянии центральной нервной системы и адренергической иннервации.
При воздействии на экстерорецепторы фармакологическими веществами чаще всего изменяют чувствительность (болевую, тактильную и температурную). При воздействии на интерорецепторы вызывают изменение состояния их во внутренних органах, сосудах и др. (горечи, сладкие, ароматические, местноанестезирующие, слизистые, вяжущие, слабительные вещества и др.).
Для действия на проводящие пути практически применяют местноанестезирующие вещества. На принципе раздражения рецепторов афферентных нервов основано слабительное влияние гипертонических растворов солей, действие горьких и сладких веществ, эмодина и хризофановой кислоты. Для действия на центры, воспринимающие импульсы от рецептора, используются в зависимости от потребности все вещества, влияющие на центральную нервную систему.
К наиболее изученным холинорецепторам относят прежде всего М-холинорецепторы. Установлено, что в них есть три центра, реагирующие с функциональными группами ацетилхолина:
1 - анионный центр (реагирует с катионным центром медиатора),
2 - центр кислородный (реагирует с эфирным кислородом медиатора)
3 - центр карбонильно-кислородный (реагирует е карбонильным кислородом ацетилхолина или с соответствующими ему активными группами (рис. 3).
Все эти три центра находятся в рецепторе в очень точном взаиморасположении и только в этих условиях они воспринимают ацетилхолин. Структура рецепторов очень различна.
Большой научный и практический интерес представляет открытие рецепторов мозга. Примером этого могут быть новые данные об опиатных рецепторах. Известно, что антагонистом опиатов является налоксон. Эксперименты с этим препаратом показали, что в гомогенате мозга крыс опиаты тормозят способность налоксона активно связываться с тканями мозга. Было высказано предположение, что опиаты и налоксон связываются с одними и теми же рецепторами. Основанием для этого было также то, что связывание налоксона разными опиатами коррелировано с их анальгезируюшей активностью. Последующие эксперименты в разных направлениях подтвердили наличие опиатных рецепторов в тканях мозга. Наибольшее количество их обнаружено в лимбической системе - в стриатуме, гипоталамусе, миндалинах и очень мало в мозжечке и спинном мозге.
Рис. 2. Схематическое изображение медиаторных путей в головном мозге:
НА - норадреналиновые пути;
ДА-дофаминовые пути (левая половина рисунка);
С - серотониновые пути (правая половина рисунка);
1 - лимбический отдел переднего мозга;
2 - неостриатум;
3 - новая кора;
4 - палеостриатум;
5 - зрительный бугор;
6 - гипоталамус;
7 - средний мозг;
8 - варолиев мост;
9 - продолговатый мозг;
10 - спинной мозг.
Доказано, что опиатоподобное вещество мозга состоит из двух пентапептидов, названных энкефалинами. Один (мет-ЭНК) - Н-тирозин-глицин-глицин-фенил-аланин-метидин-ОН, второй (лей-ЭНК) - Н-тирозин-глицин-глицин-фенил-аланин-лейцин-ОН. Природные и синтетические энкефалины по анальгезирующему эффекту, по механизму действия и по отношению к налоксону имеют много сходного с опиатами, а по химическому составу - с некоторыми пептидами мозга, в частности у них такая же последовательность аминокислот (61- 65), как и в гормоне гипофиза бета-липотропине.
Современное изучение бета-липотропина и разных частей его молекулы показало, что опиатоподобной активностью обладает ряд полипептидов, выделенных из задней доли гипофиза и гипоталамуса. Этим пептидам дано название эндорфины (эндогенные морфины). Более того, установлено, что некоторые эндорфины активнее энкефалинов.
Изучение биологической роли энкефалинов и эндорфинов привело к предположению, что их влияние проявляется не только в регулировании процессов боли и обезболивания, но и эмоциональных процессов. Установлено, что эндорфины, помимо анальгетического влияния, оказывают выраженное седативное и каталептическое действие подобно нейролептикам.
Синапсы - специализированные нервные образования, где происходит контакт между возбудимыми клетками (рис. 4). Они необходимы для осуществления функции передачи и преобразования сигналов. Иными словами, они обеспечивают проявление активности нервной системы и интегративную деятельность мозга.
Рис. 3. Схема строения М- и Н-холинорецепторов и взаимодействие с ними ацетилхолина
А - М-холинорецептор;
I
II - центр реакции холинорецептора с эфирным кислородом АХ;
III - центр реакции холинорецептора с карбонильным кислородом АХ;
IV- центр реакции холинорецептора с гидроксилом кислотной части холинолитика.
Заштрихованные участки- места связи (по типу связи Ван-дер-Ваальса) холинорецептора с М-холинолитиками;
Б - Н-холинорецептор;
I - анионный центр, взаимодействующий с положительно заряженным атомом азота («катионная головка») АХ;
II - центр с частично отрицательным зарядом, реагирующий с эфирным кислородом АХ;
III - дополнительный анионный центр.
Заштрихованные участки - места связи (по типу связи Ван-дер-Ваальса) холинорецептора с Н-холиноблокаторами;
штриховыми линиями обозначены места связи центров холинорецептора с активными группами АХ.
Передача в синапсах осуществляется при посредстве медиаторов. Медиаторы не только осуществляют передачу импульса на рецепторы постсинаптических мембран, но и изменяют проницаемость мембран для ионов, вызывают генерацию местного нерегенеративного потенциала. Граница соприкосновения осуществляется через две мембраны - пресинаптическую и постсинаптическую, а пространство между ними принято называть синаптической щелью.
Пресинаптическая мембрана является завершающейся частью поверхностной мембраны оксонального окончания; она имеет сложную проницаемость (некоторые даже считают, что у нее есть отверстия для выделяемого медиатора). Постсинаптическая мембрана не имеет отверстий, но она избирательно проницаема для медиатора с пресинаптической мембраны.
Синапсы пресинаптических окончаний имеют синаптические пузырьки, наполненные медиатором высокой концентрации. Эти медиаторы под влиянием нервного импульса выходят из пузырьков в местах перерыва мембраны, проникают в синаптическую щель и контактируют с постсинаптической мембраной. Фармакологическое воздействие на синапсы очень простое - ускорить или замедлить введение в действие как возбуждения, так и угнетения заключается в том, что нервный импульс, проходящий в пресинаптическое окончание, вызывает деполяризацию пресинаптической мембраны, изменяет ряд свойств ее, в том числе увеличивает проницаемость ионов кальция.
Ионы кальция в пресинаптической мембране ускоряют освобождение медиатора из пузырьков. Медиатор легко диффундирует, проходит через синаптическую щель и реагирует с рецепторами постсинаптической мембраны; этот процесс ярко выражен, так как в это же время происходит генерация потенциала постсинаптического и увеличение проницаемости синаптических мембран для одного или нескольких ионов. При возбуждении синапсов увеличивается натриевая проводимость (а часто, одновременно с ней, и калиевая) (рис. 5).
Этот процесс сопровождается деполяризацией и возбуждением мембраны постсинаптической клетки. Под влиянием медиаторов тормозящих увеличиваются проницаемость постсинаптических мембран для ионов хлора и явления гиперполяризации. В ряде случаев медиатор, кроме указанных процессов, влияет на метаболизмы постсинаптического нейрона и тогда фармакологический эффект усложняется.
Рис. 4. Схема нервно-мышечного синапса и фазы передачи возбуждения в нем
А - состояние покоя;
Б - состояние возбуждения;
В - восстановление исходного состояния
1 - окончание нервного волокна;
2 - ацетилхолин;
3 - пресинаптическая мембрана;
4 - постсинаптическая мембрана;
5 - холинорецептор;
6 - мышечное волокно.
Очень важная часть синапсов - своеобразные везикулы, расположенные в основной массе в аксональных окончаниях в непосредственной близости от синаптической мембраны. Везикулы проходят в синаптическую щель и контактируют с постсинаптической мембраной.
Рис. 5.
А. Мембранный потенциал покоя основан на движении наружу некоторого количества ионов калия; меньшее количество ионов натрия проникает в клетку, но концентрации обоих ионов внутри поддерживаются натриевым насосом.
Б. Нервный импульс характеризуется направленным внутрь движением большого количества ионов натрия.
В. Во время наступающего вслед за этим рефрактерного периода проницаемость для ионов натрия снова уменьшается, а затем заметное движение ионов калия наружу восстанавливает состояние покоя.
Освобождающийся медиатор вступает в соединение с хеморецептивным веществом, обусловливая деполяризацию мембраны и сильно повышая проницаемость ее для ионов. Одновременно с этим возникает постсинаптический потенциал, в постсинаптической мембране появляется ток действия мышечного волокна, ток проходит по волокну, и оно сокращается.
Основной функцией синапсов является передача возбуждения, но в них происходит также перестройка и трансформация проходящих импульсов. И этот процесс регулируется центральной нервной системой, превращением премедиаторов и др.
Биологические мембраны - гибкие, лабильные, постоянно обновляющиеся образования, часто называемые мембраной плазмолитической или цитоплазматической. Нужно иметь в виду, что они функционально очень активные поверхностные структуры клеток. Внутри клетки имеются мембраны для всех ее структур - митохондриальные, лизосомальные, ядерные и др.
Мембраны обеспечивают ограничение цитоплазмы и внутриклеточных структур, образуют единую систему канальцев, складов и замкнутых положений в клетке. Они выполняют разные сложные функции жизнедеятельности: формирование клеточных структур, содержание внутриклеточного гомеостаза, участие в процессах возбуждения и проведения нервного импульса, фото-, механо- и хеморецепцию, всасывание, секрецию и газообмен, тканевое дыхание, запасание и трансформацию энергии и т. п.
Совершенно ясно, что все эти функции нарушаются при разных патологических состояниях. Они существенно изменяются под воздействием лекарственных веществ. Роль мембран в механизме действия лекарственных вешеств раскрывается все больше и больше, и для уяснения этого необходимо полнее представлять основы их строения и влияния на физиологические процессы.
Биологические мембраны имеют сложное строение. Содержание липидов в них составляет 25-70%.
Липидный состав очень богатый и легко изменяется; общим является наличие липидов, проявляющих одновременно гидрофильные и гидрофобные свойства.
Разнообразны по составу и белки. Все они частично или полностью пронизывают липидный слой; из белков особое функциональное значение имеют ферменты и белки транспортных систем.
Очень важной является транспортная функция мембраны, обеспечивающая поддержание внутриклеточного гомеостаза, возбуждение и проведение нервного импульса, трансформацию энергии, процессы метаболизма и др.
Транспорт происходит очень быстро, движение ионов происходит как активно, так и пассивно. Функцию активной резорбции осуществляют специфические липопротеиновые структуры, пронизывающие мембрану. Эти структуры выполняют роль ионных каналов, и селективную активность их обусловливают конфигурация протоков, электрический заряд структур. Важной особенностью для пассивного продвижения ионов натрия и калия является зависимость от количества кальция в клетке (чем она больше, тем легче продвигаются и натрий, и калий).
Активный транспорт хорошо изучен в отношении ионов натрия, калия, кальция и водорода. Для примера можно привести натриево-калиевый насос, функционирующий за счет энергии АТФ.
Предполагают, что натриево-калиевый насос обусловлен липопротеиновой глобулой с двумя белковыми субъединицами, у которой на внутренней стороне мембраны имеются центры связывания АТФ, фосфата и натрия, а на наружной - центры связывания калия.
В результате конформационных перестроек ионосодержащего фосфорилированного фермента ионы натрия и калия освобождаются и транспортируются.
Структура глобулы кальциевого насоса, находящаяся в мембранах саркоплазматического ретикулума, функционирует сходно с натриевым. Основным компонентом насоса является кальцийзависимая АТФ-аза; механизм переноса иона кальция и АТФ-азной реакции включает образование фосфорилированного промежуточного продукта и последующий гидролиз его.
Активный транспорт ионов водорода происходит в сопрягающихся мембранах, где он обеспечивается энергией АТФ-аз.
Перенос неэлектролитов (органических веществ) осуществляется разными механизмами. Он часто совпадает со свободной диффузией, но происходит в 30-50 раз быстрее и поэтому обозначается как облегченная диффузия. В принципе этот транспорт должен выравнивать трансмембранные коэффициенты. И он очень часто изменяется, в связи с тем, что разные неэлектролиты активно включаются в обменные процессы, а от этого количество их быстро меняется.
Полагают, что облегченная диффузия обусловлена прежде всего специфическим узнаванием транспортируемого вещества, связыванием его переносчиком (транспортным белком), затем перенос через мембрану.
В заключение происходит диссоциация транспортированного комплекса. Очень часто процесс облегченной диффузии используется для повышения концентрации транспортируемого вещества. В этих случаях мобилизуется энергия не за счет АТФ, а в виде электрохимического градиента ионов, создаваемого ионными насосами.
Так же сложно, как транспортирование, осуществляется генерация биоэлектрических потенциалов, проведение возбуждения по нервным и мышечным клеткам, а также в местах синаптических окончаний.
Любое лекарственное вещество вызывает несколько изменений функции разных физиологических систем и хода биохимических процессов. И каждое из изменений имеет свои предпосылки или причины, называемые в фармакологии механизмом действия.
Механизмы действия это по существу теории действия, подкрепленные экспериментом.
Любое действие лекарственного вещества начинается с взаимодействия его с определенными структурами клеток или физиологических систем организма. В итоге этого изменяются взаимоотношения, состав или свойства вступившей в реакцию с лекарственным веществом структуры клетки, а как следствие, изменяются взаимоотношения этой структуры с разными органами и системами.
Четкое понимание механизмов действия лекарственных веществ в тех или иных направлениях имеет большое значение для определения наиболее ценного препарата.
Мишень - это молекула с центром связывания для лекарства. Эта молекула может содержать мембранные белки, распознающие гормоны или нейротрансмиттеры (рецепторы), а также ионные каналы, нуклеиновые кислоты, молекулы-переносчики или ферменты. Но не все лекарства действуют на рецепторы.
Большинство лекарств должны связаться с молекулярной мишенью, чтобы произвести эффект, но существуют и исключения. Уже в первых исследованиях эффектов лекарств на тканях животных в конце XIX в. стало ясно, что большинство лекарств реализуют специфическое действие в определенных тканях, т.е.:
Лекарство, которое оказывает эффект на один тип ткани, может не влиять на другой;
лекарство может оказывать совершенно разные эффекты на разные ткани.
Например, алкалоид пилокарпин , как и нейротрансмиттер ацетилхолин, вызывает сокращение гладких мышц кишечника и тормозит частоту сердечных сокращений. С учетом этих феноменов Сэмуэль Лэнгли (1852-1925) в 1878 г., основываясь на изучении эффектов алкалоидов пилокарпина и атропина на слюноотделение, предположил, что «существуют некие рецепторные вещества... с которыми оба могут образовывать соединения».
Позже, в 1905 г ., изучая действие никотина и кураре на скелетные мышцы, он обнаружил, что никотин вызывает сокращения, когда действует на определенные небольшие участки мышц. Лэнгли заключил, что «рецепторная субстанция» для никотина находится в этих участках и что кураре действует путем блокады взаимодействия никотина с рецептором.
Считается, что Пауль Эрлих (1854-1915) самостоятельно разработал теорию рецепторов, наблюдая, как многие органические красители селективно окрашивают специфические компоненты клетки. В 1885 г. он предположил, что у клеток есть «боковые цепи», или «рецепторы», к которым лекарства или токсины могут присоединяться, реализуя свое действие. До сих пор Эрлих известен благодаря своей идее о «волшебной пуле» - химическом соединении, образованном для выявления селективной токсичности, например, инфекционного агента.
Кроме того, Эрлих синтезировал органические производные мышьяка, которые использовали ранее при лечении . Развивая теорию рецепторов, Эрлих был первым, кто показал, что быстрая обратимость действия алкалоидов свидетельствует о непрочных (нековалентных) химических связях между лекарством и рецепторами.
Последние достижения молекулярной биологии раскрывают природу связи лекарство-рецептор на молекулярном уровне. Сегодня под рецептором понимают специфическую молекулярную структуру, которая работает как молекулярная мишень для группы соответствующих лекарств (раньше связывающий центр не был определен отдельно от молекулярной мишени, и весь комплекс в целом рассматривали как рецептор).
Для лекарств , действующих на ферменты, молекулярной мишенью является фермент. Рецептором выступает та часть фермента, которая связывается с лекарством. Для большинства лекарств молекулярными мишенями являются белки, углеводы, липиды и другие макромолекулы, на которые направлено действие препаратов. С этой позиции молекулярные мишени определены более точно, чем другие рецепторы.
Сегодня рецепторы определены и охарактеризованы с помощью методов молекулярной биологии. Действие некоторых типов лекарств легко объяснить без вовлечения молекулярных мишеней человека. К этим типам лекарств относятся антациды (буферы), которые уменьшают кислотность в желудке, формообразующие слабительные и комплексо-образователи. Есть вещества, для механизма действия которых характерно отсутствие четкой химической специфичности. Основным примером являются газообразные и летучие общие анестетики, включая инертный газ ксенон.
Для этих препаратов практически невозможно определить связывающий центр или одну молекулярную мишень. Тем не менее, вероятно, их фармакологические эффекты происходят из-за действия на компонент мембран (например, потенциал- или лиганд-зависимые ионные каналы). Этот компонент и является молекулярной мишенью для анестетиков.
ятии:
Носители генетической информации у микроорганизмов.
Формы проявления изменчивости микроорганизмов. Модификации. Мутации, их классификация. R-S диссоциации. Практическое значение изменчивости микроорганизмов.
Мутагены, классификация, механизм действия мутагенов на геном микроорганизмов.
Роль цитоплазматических генетических структур в изменчивости микроорганизмов.
Генетические рекомбинации.
Трансформация, стадии процесса трансформации.
Трансдукция, специфическая и неспецифическая трансдукция.
Конъюгация, стадии процесса конъюгации.
1. Указать правильные ответы в тестовых заданиях.
1. Просмотр и зарисовка демонстрационных препаратов:
А) R-S диссоциация бактерий.
Контрольные вопросы:
Что является материальной основой наследственности микроорганизмов?
Какие существуют формы проявления изменчивости микроорганизмов?
Каково практическое значение изменчивости микроорганизмов?
Что такое модификации?
Что такое мутации?
Какая существует классификация мутаций?
Что такое мутагены?
Каков механизм действия мутагенов на геном микроорганизмов?
Какова роль цитоплазматических генетических структур в изменчивости микроорганизмов?
Что такое генетические рекомбинации?
Что такое трансформация? Какие стадии выделяют в этом процессе?
Что такое трансдукция?
Что такое конъюгация? Какие стадии выделяют в этом процессе?
ТЕСТОВЫЕ З АДАНИЯ
Указать правильные отв еты:
1. Что относят к внехромосомным генетическим структурам?
А) рибосомы
Б) полисомы
В) плазмиды
Г) мезосомы
Д) транспозоны
2. Что такое мутагены?
А) гены, обеспечивающие мутацию
Б) факторы, вызывающие мутацию
В) факторы, передающие генетическую информацию
Г) факторы, восстанавливающие ДНК
3. Что такое экзон?
А) вирулентный бактериофаг
Б) профаг
В) участок гена, несущий определенную генетическую информацию
Г) умеренный бактериофаг
4. Что такое инверсия?
А) способ генетической рекомбинации
Б) исправление поврежденных участков ДНК
В) хромосомная мутация
Г) точковая мутация
5. Что такое модификация?
Б) фенотипические изменения, не затрагивающие генома клетки
В) передача генетического материала при помощи бактериофага
Г) наследственное скачкообразное изменение признака
6. Для конъюгации характерно:
А) передача генетического материала при помощи бактериофага
Б) необходим контакт клеток донора и реципиента
В) передача генетического материала с помощью РНК
Г) передача генетического материала с помощью полового фактора
7. Что такое репарация?
А) лизогения
Б) восстановление поврежденной ДНК
В) способ передачи генетической информации
Г) виропексис
8. Чем характеризуется «минус» цепь РНК?
А) обладает инфекционной активностью
Б) несет наследственную функцию
В) способна встраиваться в хромосому клетки
Г) не обладает функцией информационной РНК
9. У каких микроорганизмов материальной основой наследственности является РНК?
А) у бактерий
Б) у спирохет
Д) у микоплазм
10. Что такое мутации?
А) исправление поврежденных участков ДНК
Б) передача генетического материала при помощи бактериофага
В) наследственное скачкообразное изменение признака
Г) процесс образования бактериального потомства, содержащего признаки донора и реципиента
11. Что такое трансформация?
А) восстановление поврежденной ДНК
Б) передача генетической информации при контакте бактериальных клеток разной «половой» направленности
В) передача генетической информации с помощью фрагмента ДНК
Г) передача генетической информации от клетки донора клетке реципиента с помощью бактериофага
ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТ ЕРИАЛ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ
Постановка опыта трансформации
Реципиент - штамм Bacillus subtilis Str (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину); донор - ДНК, выделенная из штамма В. Subtilis Str (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомби-нантов (трансформантов) питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.
К 1 мл бульонной культуры В. Subtilis добавляют 1 мкг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл раствора хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры в изотоническом растворе хлорида натрия готовят 10-кратные разведения до 10 -5 -10 -6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину. Посев инкубируют, при 37 0 С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.
Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципи-ентного штамма в разведении 10 -5 выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси - 68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клеткой, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170 х 10 5 жизнеспособных клеток, а в 1 мл - 170 х 10 6 , или 1,7 х 10 8 . В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в 1 мл - 680, или 6,8 х 10 2 .
Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна:
Постановка опыта специфической трансдукции
Реципиент - штамм Е. coli lac - , лишенный 3-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг - фаг X dgal, в геноме которого часть генов замещена (3-галактозидазным опе-роном Е. coli. Он является дефектным, т. е. не способен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг dgal) с названием содержащегося в геноме бактериального оперона gal. Селективная среда - среда Эндо, на которой лактозоотрицательные бактерии реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком. К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага dgal в концентрации 10 6 - 10 7 частиц в 1 мл. Смесь инкубируют в течение 60 мин при 37 0 С, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого количества колоний. Из пробирки с разведением 10 -6 делают высев по 0,1 мл культуры на 3 чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды.
Посевы инкубируют в течение 1 суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (транс-дуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.
Например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в разведении 10 -6 на 3 чашках со средой Эндо выросло соответственно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, на первой и последней чашках - 5 и 1 колонии трансдуктантов красного цвета. Следовательно, частота трансдукции в этом случае будет равна:
Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, кот орый содержит ген leu , контролирующий синтез лейцина.
Донор - штамм Е. coli K12 Hfr leu Str S ; реципиент - штамм Е. Coli K12 F - leu + Str R . Hfr - обозначение состояния, для которого характерна высокая частота рекомбинации. Селективная среда для выделения рекомбинантов -минимальная глюкозосолевая среда: КН 2 РО 4 - 6,5 г, MgSO 4 - 0,1 г, (NH 4)2SO 4 - 1 г, Ca(NO 3)2 - 0,001 г, FeSO 4 - 0,0005 г, глюкозы - 2 г, стрептомицина - 200 ЕД/мл, дистиллированной воды - 1 л.
К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 0 С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10 -2 -10 3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают донорский и реципиентный штаммы, которые не будут расти на ней, т. к. первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорского штамма высевают на селективную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма - на полную среду (питательный агар) с антибиотиками для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют при 37 0 С до следующего дня. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.
Например, после посева 0,1 мл смеси донорских и реципиентных культур в разведении 10 -2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципиента из разведения 10 -6 75 колоний. Таким образом, частота рекомбинации будет равна:
УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №7
Т е м а: Бактериологический метод ди агностики
инфекционных заболеваний. Питание бактерий. Принципы культивирования микроорганизмов. Питательные среды. Методы стерилизации
Учебная цель: Освоить бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Изучить типы питания бактерий, принципы культивирования микроорганизмов, классификацию питательных сред и методы стерилизации.
Необходимый исходный уровень знаний: Физиология микроорганизмов.
Практические знания и умения, которые должен получить студент на занятии:
| Знать | Уметь |
| 1. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний, его цель и этапы | 1. Приготовить питательные среды |
| 2. Типы питания бактерий | 2. Оценить эффективность стерилизации и дезинфекции |
| 3. Принципы культивирования микроорганизмов | |
| 4. Питательные среды, требования, предъявляемые к питательным средам | |
| 5. Классификация питательных сред, состав и приготовление | |
| 6. Методы стерилизации | |
| 7. Механизм действия стерилизующих факторов на молекулярную структуру микроорганизмов | |
| 8. Отличия понятий контаминации и деконтаминации, дезинфекции и стерилизации, асептики и антисептики | |
| 9. Классификация инструментов, приборов, способов обработки и видов воздействия | |
| 10. Современные технологии стерилизации и аппаратура | |
| 11. Способы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции |
Вопросы, рассматриваемые на зан ятии:
Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний, его цель и этапы.
Типы питания бактерий.
Принципы культивирования микроорганизмов.
Питательные среды; требования, предъявляемые к питательным средам.
Классификация питательных сред, их состав и приготовление.
Методы стерилизации: физические, химические, биологические и механические.
Микроб как объект стерилизации и дезинфекции. Связь со строением микробной клетки. Основные мишени молекулярной структуры микроорганизмов при стерилизующих и дезинфицирующих воздействиях.
Отличия понятий контаминации и деконтаминации, дезинфекции и стерилизации, асептики и антисептики.
Классификация инструментов, приборов, способов обработки и видов воздействия для стерилизации и дезинфекции.
Современные технологии стерилизации и аппаратура.
Способы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции.
Самостоятельная работа студентов:
1. Опыт по определению действия высокой температуры (80°С) на спорообразующие (антракоид) и аспорогенные (кишечная палочка и стафилококк) микроорганизмы.
Преподаватель разъясняет опыт:
А) на каждый стол даётся взвесь стафилококка, кишечной палочки и споровой палочки (антракоида);
Б) делается посев каждой взвеси на косой агар до прогревания;
В) исследуемые взвеси помещаются на водяную баню при температуре 80 0 С на 20 минут;
Г) делается посев каждой взвеси на косой агар после прогревания;
Д) заполняется протокол по форме:
Вегетативные формы патогенных микроорганизмов погибают при 50-60 0 С в течении 30 минут, а при температуре 70 0 С в течении 5-10 минут. Споры бактерий обладают большей устойчивостью к высоким температурам, что объясняется содержанием в них воды в связанном состоянии, большим содержанием солей кальция, липидов и плотностью, многослойностью оболочки. Следовательно, стафилококк и кишечная палочка после прогревания погибают, а споры антракоида выживают. Это и надо учитывать в оценке результатов посева.
2. Заполнить самостоятельно таблицу:
| № | Способ стерилизации | Аппарат | Надёжность | Стерилизуемый материал |
| 1. | Стерилизация в пламени | |||
| 2. | Плазменная Стерилизация | |||
| 3. | Сухой жар | |||
| 4. | Паром под давлением | |||
| 5. | Текучим паром | |||
| 6. | Тиндализация | |||
| 7. | Фильтрование | |||
| 8. | Физические факторы (УФЛ, гамма-лучи, ультразвук) | |||
| 9. | Газовая стерилизация | |||
| 10. | Пастеризация |
3. Указать правильные ответы в тестовых заданиях.
Практическая работа студентов:
1. Просмотр демонстрационных препаратов и приборов:
А) питательных сред (МПБ, МПА, кровяной агар, сывороточный агар, среды Гисса, среда Эндо, среда Плоскирева);
Б) печи Пастера, автоклава.
Контрольные в опросы:
Какие цели и этапы бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний?
Что такое питание бактерий?
Какие существуют типы питания бактерий?
Каковы принципы культивирования микроорганизмов?
Что такое питательные среды?
Какие требования предъявляются к питательным средам?
Какая существует классификация питательных сред?
Как готовятся питательные среды?
Что такое стерилизация?
Какие существуют методы стерилизации?
В чем разница между понятиями контаминация и деконтаминация, дезинфекция и стерилизация, асептика и антисептика?
На какие клеточные структуры микроорганизмов действуют стерилизующие и дезинфицирующие факторы?
Какая существует классификация инструментов, приборов, способов обработки и видов воздействия для стерилизации и дезинфекции?
Какие известны современные технологии стерилизации и аппаратура?
Какие используются способы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции?
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
Укажите правильные ответы:
1. Какие питательные среды являются простыми?
А) среда Эндо
В) кровяной агар
Д) пептонная вода
2. Что такое стерилизация?
А) полное обеспложивание объектов от всех видов микробов и их спор
Б) уничтожение патогенных микроорганизмов
В) уничтожение вегетативных форм микроорганизмов
Г) предотвращение попадания микроорганизмов в рану
Д) уничтожение на объектах конкретных видов микробов
3. Какие факторы используются при автоклавировании?
А) температура
Б) фильтры
Г) давление
4. Какие факторы используются в печи Пастера?
А) давление
В) сухой жар
Г) антибиотики
5. Питательные среды по назначению делятся на:
А) простые
Б) элективные
В) жидкие
Г) дифференциально-диагностические
Д) транспортные
6. По отношению к факторам роста микроорганизмы делятся на:
А) аутотрофы
Б) гетеротрофы
В) ауксотрофы
Г) литотрофы
Д) прототрофы
Е) органотрофы
7. Оптимальной температурой для выращивания большинства патогенных микроорганизмов является:
8. К физическим методам стерилизации относятся:
А) ультразвук
Б) ультрафиолетовые лучи
В) антибиотики
Г) фильтрование
Д) паровая стерилизация
Е) сухожаровая стерилизация
9. На рост бактерий влияют следующие условия культивирования:
Б) рН среды
В) температура
Г) влажность среды
Д) факторы роста
Е) все ответы неправильные
10. Плотность питательных сред зависит от содержания в них:
А) хлорида натрия
Б) пептона
В) агар-агара
Г) сахарозы
Д) сыворотки крови
11. Микробы, использующие неорганические источники углерода и окислительно-восстановительные реакции для получения энергии, называются:
А) хемоорганотрофами
Б) фотоорганотрофами
В) хемолитотрофами
Г) хемоаутотрофами
Д) хемоауксотрофами
12. Перечислите способы стерилизации, освобождающие объект от споровых форм микробов:
А) облучение ультрафиолетом
Б) автоклавирование
В) пастеризация
Г) сухим жаром
Д) гамма-облучение
13. Расположите в правильной последовательности процессы обработки лабораторного инстументария:
А) предстерилизационная очисткастерилизация
Б) предстерилизационная очисткастерилизациядезинфекция
В) предстерилизационная очисткадезинфекция-стерилизация
Г) дезинфекцияпредстерилизационная очисткастерилизация
14. Комплекс мероприятий, направленных на уничтожение патогенных микроорганизмов, называется:
А) асептика
Б) антисептика
В) дезинфекция
Г) стерилизация
Д) тиндализация
ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ
Микробиологическое исследование проводится с целью выделения чистых культур микроорганизмов, культивирование и изучения их свойств. Оно необходимо при диагностике инфекционных болезней, для определения видовой принадлежности микробов, в исследовательской работе, для получения продуктов жизнедеятельности микробов (токсинов, антибиотиков, вакцин и т. п.). Для выращивания микроорганизмов в искусственных условиях необходимы особые субстраты - питательные среды. Они являются основой микробиологической работы и определяют результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные условия для жизнедеятельности микробов.
ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕД ЬЯВЛЯЕМЫЕ К СРЕДАМ:
Должны быть питательными, т. е. содержать в легкоусвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей микроорганизмов.
Иметь оптимальную концентрацию водородных ионов.
Быть изотоничными для микробной клетки.
Быть стерильными.
Быть влажными.
Обладать определённым окислительно-восстановительным потенциалом.
Быть по возможности унифицированными.
| Группа классификации | Класс | Примеры |
| По составу | Простые | Жидкие - МПБ, пептон-ная вода Пло тные - МПА |
| Сложные | Жидкие - сахарный бул ьон Плотные - сахарный агар, кровяной агар |
|
| По происхожде нию | Естественные | Молоко, свёрнутая сыв оротка, срез сырого картофеля |
| Искусственные | Молочно-солевой агар С ывороточный агар Асцит-агар Кровяной агар |
|
| Синтетические | Среда Игла, среда 199 |
|
| По назначе нию | Селективные (элективные) -для стафилококка: -для грам(-) кокков и дифтероидов: -для энтеробактерий: -для холерного вибриона: -для лактобацилл и грибов
| Молочно-солевой агар, жел-точно-солевой агар Сывороточные среды Среды с солями теллура Среды с солями желчных кислот Пептонный бульон и ще лочной агар Томат-агар, рисовый агар, агар Сабуро
|
| По консисте нции | Дифференциально-диагностические Универсальные Среды обогащения Консервирую щие Жидкие Полужидкие Плотные
| Эндо, Плоскирева, Левина, Ресселя, Гисса МПБ, МПА, кровяной агар Среда Мюллера Среды с глицерином МПБ, пептонная вода, сахарный МПБ МПЖеле, желати новая МПА, кровяной агар
|